1. INTRODUCCIÓN

El queso es un alimento, que aporta a la dieta de la población, a la vez que constituye un bien cultural alimentario, y sustenta una cadena de valor local de importancia económica, que puede contribuir al desarrollo local y regional (1).

Entre los quesos elaborados en el mundo están los quesos de pasta hilada que incluyen variedades de quesos como el Mozzarella, Provolone, Scamorza, Caciocavallo originados en el norte del mediterráneo (Italia, Grecia, los Balcanes, y Turquía), su principal característica es el tratamiento térmico aplicado una vez obtenida la cuajada , la cual es sumergida en agua, suero o salmuera calientes y se manipula mecánica o manualmente hasta obtener una consistencia plástica seguida de moldeo según la forma y tamaño deseado (2). Uno de los ingredientes de estos quesos es un cultivo iniciador empleado para incrementar la acidez de la leche y subsecuentemente de la cuajada lo que permitirá su plastificación y estiramiento por efecto del calentamiento (3).

Uno de los quesos tradicionales elaborados en Ecuador y que se encuentra en la categoría de pasta hilada, es el queso de hoja, la norma técnica ecuatoriana NTE INEN 1528, lo define como un producto no madurado obtenido a partir de queso criollo acidificado de forma natural en presencia de bacterias mesófilas nativas de Ecuador no patógenas; sometido a calentamiento previo al hilado, su característica es la envoltura en hoja de achira (Canna indica) (4).

Este producto está catalogado como patrimonio culinario de la región Sierra (5). Las ciudades en las que se elaboran y comercializan con su particular envoltura son Cayambe y Latacunga (6), sin embargo, estos quesos no cuentan con notificación sanitaria, en contraste, las plantas procesadoras de lácteos los comercializan envasados al vacío en bolsas de polietileno de alta densidad y con la respectiva notificación sanitaria.

Las queseras artesanales generalmente elaboran su producto con leche no pasteurizada, esto genera su acidificación por la actividad metabólica de las bacterias nativas, debiendo aplicarse las prácticas correctas de higiene en su elaboración para prevenir la contaminación cruzada, y evitar la presencia de microorganismos potencialmente patógenos. En el caso de los quesos de hoja procedentes de plantas industriales, al recibir la leche un tratamiento térmico, que disminuye las bacterias patógenas, también disminuye la microbiota nativa. En este marco, el objetivo del presente estudio fue evaluar la calidad microbiológica de los quesos de hoja en términos de microorganismos indicadores de la calidad higiénico – sanitaria, adicionalmente se evaluaron niveles de las bacterias ácido lácticas y se caracterizaron fenotípicamente 32 aislados.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Localización geográfica del estudio

El estudio se realizó con muestras seleccionadas de queso de hoja artesanal e industrial elaborado en la ciudad de Latacunga ( 0°56’6.8” S 78°36’55.9” O ), provincia de Cotopaxi – Ecuador.

2.2 Toma de muestras

Las muestras se tomaron de tres queseras artesanales (QHA1, QHA2, QHA3), que empacan sus productos en hojas de achira (Canna indica) y de una industria local (QHI1, QHI2), que los comercializa en bolsas de plástico de polietileno de alta densidad Figura 1.

                              Figura 1. Queso de Hoja A: industrial empacado en bolsas de plástico de polietileno de alta densidad;            B: artesanal empacado en hojas de achira

De cada quesera se tomaron aleatoriamente 2 muestras por un periodo de tres semanas consecutivas, examinando un total de 30 muestras de acuerdo a lo especificado por la Norma NTE. INEN 1529-2-2013 (7). Las muestras fueron tomadas de los lugares de comercialización.

2.3 Material y método

Para la preparación de las diluciones de las muestras de queso de hoja se trabajó, con diluciones sucesivas de orden diez según lo especificado por la norma NTE INEN 1529:2-2013 (7) utilizando como diluyente agua de peptona al 0,1.%.

2.3.a Recuento de microorganismos aerobios mesófilos

El recuento de microorganismos aerobios mesófilos se realizó de acuerdo a la norma NTE INEN 1529-5 (8), por el método de inoculación con vertido en placa, utilizando 1 mL de la dilución requerida en PCA (DIFCO 770572), incubando a 30.°C ± 1.°C de 48 a 75 h.

2.3.b Recuento de bacterias coliformes, E. coli y S. aureus

Para este ensayo se emplearon los métodos oficiales para recuentos mediante la técnica de Petrifilm, AOAC 991.14 para E. coli/coliformes (9) y AOAC 2003.07 para S. aureus (7).

2.3.c Recuento de bacterias ácido lácticas (BAL)

Para el recuento de BAL se consideró como referencia la Norma PRT-712.02-047 (10) del Instituto de Salud Pública de Chile y la Norma ISO 16068 (11), empleando el método de vertido en placa. Los recuentos de lactobacilos se realizaron en el medio MRS (Man Rogosa Sharpe, OXOID CM0361), acidificado a pH 4.5 y los recuentos de Lactococcus en el medio M17 Agar (OXOID CM0785). Se mezcló 1 mL de la dilución requerida con agar fundido, incubando las placas a 37 °C por 72 h en condiciones aérobicas para el medio MRS (10). Mientras que para el agar M17, las placas se incubaron a 32 °C por 48h en condiciones microaerofílicas utilizando el sistema de jarras Gas-Pack (10).

Para conocer la reducción del crecimiento de Lactobacillus y Lactococcus en quesos industriales respecto a BAL de quesos artesanales, se aplicó la siguiente ecuación:

% reducción=(No-Nf) / No x 100.

Donde:
No = Población de Lactobacillus o Lactococcus (valor promedio) en quesos artesanales.
Nf = Población de Lactobacillus o Lactococcus (valor promedio) en quesos industriales.

2.3.d. Caracterización fenotípica de aislados de BAL

Los cultivos de BAL provenientes de queseras artesanales e industriales se examinaron macroscópicamente previa la selección de colonias de morfología más representativa, cada colonia se purificó mediante 3 transferencias sucesivas en un nuevo medio de cultivo hasta la obtención de cultivos puros, después cada colonia se examinó para la respuesta al Gram y los ensayos: catalasa, oxidasa, movilidad, crecimiento a 10 °C y 45 °C, en medio salino con concentración de NaCl 6.5 % y NaCl 18 %, a pH 4.4 y pH 9.6 además la producción de CO2 a partir de glucosa.

Análisis estadístico
Los resultados de los ensayos de enumeración de los indicadores de higiene y de BAL, se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza de una vía, seguido por el test de Tukey (P <0.05) empleando el software INFOSTAT 2017 para determinar las diferencias significativas.

3. RESULTADOS

3.1 Recuento de microorganismos indicadores de calidad higiénico-sanitaria

En la Tabla 1 se aprecia la diferencia en los niveles poblacionales de algunos indicadores de calidad higiénico-sanitaria (Coliformes, E. coli, S. aureus) en los quesos de hoja de elaboración artesanal e industrial.

Tabla 1. Recuentos de microorganismos indicadores de la calidad higiénico-sanitaria

Muestras                     Aerobios                   Coliformes                    E. coli                      S. aureus
Mesófilos
QHA1                         9,18 a ± 0,04             5 ,67a ± 0,08            1,80a ± 0,06             3,46a ± 0,04
QHA2                        8,59 a± 0,10              6,56a ± 0,17                         0                       3,38a ± 0,07
QHA3                        9,35a ± 0,08              6,35a± 0,10               1,67a ± 0,00             3,41a ± 0,11
QHI1                          7,81 b ± 0,06             3,64 b ± 0,07                       0                                  0
QHI2                         7,36 b ± 0,03             3,65 b ± 0,07                       0                                   0

a-b Valores de grupos microbianos en quesos, dentro de una misma columna, que no comparten el mismo superíndice son significativamente diferentes(P< 0.05). Los valores expresados en Log UFC/g se presentan como las medias ± la desviación estándar de 3 réplicas procedentes de 2 muestras de queso de hoja artesanal (QHA) o industrial (QHI), que representan a un total de 30 muestras

3.2 Recuento de Bacterias ácido lácticas

En la Tabla 2 se muestran los niveles poblacionales de bacterias ácido lácticas (Lactobacillus y Lactococcus) expresados en Log 10 UFC/g en los quesos de hoja de elaboración artesanal e industrial.

Tabla 2. Niveles de Lactobacillus y Lactococcus

Muestras                  Lactobacillus                         Lactococcus
QHA1                        9,16 ax ± 0,27                       9,39 ax ± 0,26
QHA2                       8,76 ax ± 0,09                       9,15 ax ± 0,34
QHA3                       9,35 ax ± 0,22                       9,41 ax ± 0,15
QHI1                         7,82 bx ± 0,04                      8,27 by ± 0,04
QHI2                        7,06 bx ± 0,08                       7,70 by ± 0,06

a-b Valores de grupos microbianos en quesos, dentro de una misma columna, que no comparten el mismo superíndice son significativamente diferentes (P< 0.05).
x-y Valores de grupos microbianos en quesos, dentro de una misma fila, que no comparten el mismo superíndice son significativamente diferentes (P< 0.05).
Los valores expresados en Log UFC/g se presentan como las medias ± la desviación estándar de 3 réplicas procedentes de 2 muestras de queso de hoja artesanal (QHA) o industrial (QHI), que representan a un total de 30 muestras

3.3 Caracterización metabólica de cepas BAL

Se examinaron 18 aislados en el medio MRS y 14 en el medio M17 incubado en condiciones anaerobias, de los cuales 21 provinieron del queso de hoja artesanal y 11 del industrial. Los aislados de presuntas BAL purificadas, cuyos ensayos de identificación fenotípica les presenta como colonias lenticulares de color blanco, que agrupan bacilos o cocos Gram (+), catalasa (-), oxidasa (-), no mótiles, condujeron a la caracterización de los géneros Lactobacillus y Lactococcus como parte de la microbiota responsable de la formación del queso de hoja y de sus atributos sensoriales: olor, sabor, flavor y textura.

En la figura 2 se muestran los seis grupos del BAL caracterizados en función de su morfología y su respuesta metabólica frente al crecimiento bacteriano a diferentes temperaturas, concentración salina, variación de pH y producción de CO₂ a partir de glucosa.

Grupo A: Lactobacillus s.p Crecimiento a 10 °C y 45 °C (+); NaCl 6.5 % (+); NaCl 18% (-); pH 4.4 (+); pH 9.6 (+); CO₂ de la glucosa (-).
Grupo B: Lactobacillus s.p Crecimiento a 10 °C y 45 °C (+); NaCl 6.5% (+); NaCl 18% (-); pH 4.4 (+); pH 9.6 (-); CO₂ de la glucosa (-).
Grupo C: Lactobacillus s.p Crecimiento a 10 °C y 45 °C (+); NaCl 6.5 % (-); NaCl 18 % (-); pH 4.4 (-); pH 9.6 (+); CO₂ de la glucosa (-).
Grupo D: Lactobacillus s.p Crecimiento a 10 °C y 45 °C (+); NaCl 6.5 % (-); NaCl 18% (-); pH 4.4 (-); pH 9.6 (+); CO₂ de la glucosa (-).
Grupo E: Lactobacillus s.p Crecimiento a 10 °C y 45 °C (+); NaCl 6.5% (+); NaCl 18% (-); pH 4.4 (-); pH 9.6 (-); CO₂ de la glucosa (-).
Grupo F: Lactococcos s.p Crecimiento a 10°C y 45°C (+); NaCl 6.5% (+); NaCl 18% (-); pH 4.4 (-); pH 9.6 (+); CO₂ de la glucosa (-).

4. DISCUSIÓN

4.1. Recuento de microorganismos indicadores de la calidad higiénico-sanitaria

De manera global, los recuentos de coliformes, E. coli y S. aureus examinados en los quesos de hoja de elaboración artesanal e industrial superan los límites de aceptabilidad establecidos en la normativa ecuatoriana, sugiriendo pobre calidad higiénica del proceso y/o incorrecta manipulación de la leche como materia prima. Para reducir estos niveles es necesario mejorar la aplicación de las correctas prácticas de higiene tal como lo establecen los programas de HACCP (13).
Por otra parte, se aprecia diferencias estadísticamente significativas en los niveles de estos microorganismos dependiendo de su origen, los elaborados artesanalmente presentaron los niveles más altos de indicadores, en contraste en los quesos de elaboración industrial hubo ausencia de S. aureus y E. coli y una reducción de 70 % en coliformes y 19 % en aerobios mesófilos.

La reducción de la microbiota se puede atribuir a que en la elaboración industrial por lo general el control de calidad de la materia prima es riguroso, se aplica tratamiento térmico a la leche cruda, se controla las condiciones higiénico sanitarias del proceso, el grado de manipulación de los operarios es menor, además se debe considerar que el material de empaque usado, bolsas de polietileno de alta densidad, representa un envase aséptico sumado al empacado al vacío, versus hojas de vegetales, un producto natural sin cierre hermético que puede propiciar el ingreso de contaminantes.

El grupo de aerobios mesófilos comprende microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que se desarrollan a temperaturas medias, estos representan la totalidad de la carga microbiana cultivable. Su determinación es importante para la calidad y seguridad del queso debido a que existe el riesgo de la presencia de patógenos y microorganismos causantes de la descomposición del producto que sobreviven al calentamiento de la leche o al tratamiento térmico (14).

Su recuento alto en los quesos de hoja artesanales o industriales no necesariamente indican alteración inminente debido a que el queso es un alimento vivo, una matriz que está constantemente en evolución, sin embargo, en el caso de quesos de hoja, dada su naturaleza perecible este indicador si puede asociarse a calidad higiénico-sanitaria y sugerir problemas de higiene o abuso de temperaturas durante el transporte o conservación del producto.

Los coliformes agrupan a especies no categorizadas taxonómicamente, aunque están ampliamente distribuidas en el ambiente, sin embargo, existe un subgrupo cuyo origen es intestinal, siendo E. coli la especie más relevante, por la existencia de serotipos patogénicos. En realidad, el grupo coliforme se ha empleado históricamente como indicador de higiene asociado a contaminación fecal, sin embargo, varios estudios han demostrado que la mayoría de coliformes provienen de fuentes ambientales por consiguiente los niveles de coliformes en el queso raramente indicarían contaminación fecal (15), por lo tanto, la presencia de E. coli en el queso de hoja depende exclusivamente de las condiciones higiénicas deficitarias durante la producción, por contaminación de la materia prima, superficies inertes (equipos, accesorios, utensilios, pisos, paredes), del aire de la sala de elaboración y a través de los operarios, es decir este grupo puede establecerse en los quesos por contaminación cruzada.

S. aureus, es el indicador específico de contaminación a través de los manipuladores y puede transferirse al queso de hoja a partir de la leche contaminada intrínsecamente o de superficies vivas tales como la ubre de la vaca, piel, manos, uñas y cabello de los operadores, con el peligro de que su multiplicación en el queso resulte favorable para la producción de una enterotoxina termorresistente, agente de intoxicación estafilocócica (16). Las superficies inertes también son foco de contaminación y parece que no basta controlar sus niveles con limpieza y desinfección, dada su capacidad de formar biopelículas y resistir a ambientes hostiles (17).

Cabe recalcar que el queso de hoja de cualquier sistema de elaboración es susceptible de adquirir otros microrganismos secundarios mientras se combina con los componentes ambientales, en su recorrido del campo a la mesa, de modo que los indicadores pueden sobrepasar los criterios microbiológicos de aceptación.

En quesería, el paso de la elaboración casera a la producción masiva y tecnificada sin duda resulta en mayores volúmenes de producción, un mejor control en las características físicas, físico-químicas y microbiológicas, involucra además una estandarización de actividades, procesos y productos que puede reflejarse en una mejor calidad higiénica.
Además, es innegable que los quesos tradicionales de hoja, comercializados a pequeña escala pueden ser alimentos muy importantes por su contribución al desarrollo de zonas rurales del país y de su población.

4.2. Recuento de bacterias ácido lácticas

En este estudio, la mayoría de Lactobacillus son fisiológicamente similares y comparten los mismos requerimientos nutricionales, forman colonias de igual morfología al crecer en el medio de cultivo MRS a pH 5.4, el uso de este medio de cultivo acidificado, promueve el crecimiento únicamente de lactobacilos que toleran niveles de pH más bajos (pH 5.0 – 6.5) que los Lactococcus (18).

Los recuentos de Lactobacillus y Lactococcus en los quesos de hoja artesanales y de elaboración industrial variaron entre 7,06 ± 0,08 UFC/g y 9,41 ± 0,15 UFC/g, en las muestras examinadas (Tabla 2), estos valores se muestran próximos a los determinados en quesos similares de pasta hilada producidos en otras latitudes, como el queso Oaxaca muy popular en México elaborado artesanalmente con leche cruda, el cual reveló 9,8±0,8 log UFC/g de Lactobacillus (19), mientras en el queso artesanal hondureño, se encontraron niveles de BAL entre 1,00 a 8,95 log UFC/g, con un promedio general de 4.76 ± 1.99 UFC/g (20).

Los niveles poblaciones de Lactococcus y Lactobacillus fueron similares en los quesos de hoja artesanal, en el caso de los quesos industriales existe mayor cantidad de Lactococcus respecto a Lactobacillus (Tabla 2). Este resultado es similar al reportado en el queso fresco de pasta hilada Fior di latte elaborado en las regiones del sur de Italia que presentaron un nivel más elevado de cocos frente a bacilos (21).

Adicionalmente, los productos industriales se distinguen de los artesanales por la reducción poblacional de Lactobacillus en 18,15 % y Lactococcus en 14,27 %. Estas reducciones se atribuyen al efecto de un tratamiento térmico más intenso empleado durante el procesado industrial. En este caso, la tecnificación del proceso de elaboración del queso, aunque significa mejoras en la higiene y conservación del producto, reduce los niveles de BAL, que son las bacterias más importantes implicadas en el sabor, aroma y textura del queso. Se sabe que el aroma está dado principalmente por compuestos orgánicos volátiles derivados del metabolismo de la BAL y depende de aspectos tecnológicos específicos de los distintos tipos de queso (22).

4.3. Caracterización metabólica de cepas BAL

Las características organolépticas, así como la vida útil y la seguridad del queso, dependen en gran medida de la composición y la evolución de su microbiota (23). En este sentido, algunos estudios centrados en la biodiversidad bacteriana de los quesos de hoja artesanales pueden conducir al desarrollo de cultivos iniciadores y cultivos adjuntos de importancia tecnológica (24), que permitan obtener quesos de hoja industriales con mejores características sensoriales, de ahí que en el presente estudio a partir de un tamizaje rápido y económico se caracterizaron 32 cepas de BAL en función de los atributos de crecimiento y su morfología.

Dichas características permitieron la discriminación en 6 grupos (Figura 2) con base en la similitud de respuestas a los diferentes ensayos. Esta primera clasificación sirve de aproximación a la selección de BAL con características de interés para la industria quesera.

Todos los aislados de los grupos A, B, C, D, E, F, crecieron a temperaturas de 10 °C y 45° C, algunas especies como Lactobacillus plantarum pueden desarrollarse simultáneamente en estos dos valores, sin embargo, en la práctica es poco común encontrar este comportamiento. Los resultados obtenidos en esta investigación contrastan con lo anterior, ya que el 100 % de los aislados crecieron en dichas temperaturas, esto puede atribuirse a que las BAL para responder al estrés por los cambios bruscos de temperatura disponen de un mecanismo adaptativo mediante la activación de proteínas de choque térmico (HSPs) o de proteínas inducidas por el frío (CIP) cuando hay ambientes muy fríos, garantizando así su supervivencia (25).

En cuanto al crecimiento en medio MRS con NaCl, ninguno de los aislados se desarrolló en una concentración salina al 18%, coincidiendo con la mayoría de las BAL que no crecen en este ambiente, excepto Tetragenococcus (26). En cambio, los aislados de los grupos A, B, E, F, crecen en NaCl al 6.5 % a diferencia de los aislados en C y D, que no crecen bajo esta condición. En un estudio con varios quesos europeos se detectaron BAL con tolerancia al 7.0 % de NaCl, dato consistente con lo ocurrido en este estudio (27). Sin embargo, las respuestas distintas de halotolerancia pueden explicarse por la biodiversidad (28). De otro lado, la halotolerancia de las cepas analizadas, indica que estas podrían exhibir propiedades tecnológicas y enzimas de interés, no solo para la industria láctea sino para el sector biotecnológico (29). En general, se sabe que la regulación de los genes inducidos por la presión osmótica afecta al estado fisiológico y a las propiedades de las BAL, también afecta indirectamente a la formación de metabolitos (30).

En relación al pH, varias cepas mostraron variabilidad de crecimiento, según (31) el crecimiento de Lactobacillus a pH 4.4 es variable, en este sentido otro estudio (27) caracterizó cepas de BAL de quesos utilizando medios alcalinos pH 9.5; esto concuerda con los resultados obtenidos en el presente estudio.

                                   Figura 2. Número de BAL aisladas de quesos artesanales e industriales clasificadas en seis grupos                                        según su morfología y respuesta metabólica

Ningún grupo presentó producción de CO₂ por fermentación de la glucosa, cumpliendo la característica de las cepas aisladas del queso de hoja que no deberían ser formadoras de gas, rasgo que es característico de algunos quesos madurados como el Gouda (32). La no producción de gas es típica de los bacilos homofermentativos, cuyo principal producto metabólico es el ácido láctico, en cambio las BAL heterofermentativas, además de ácido láctico generan otros compuestos entre los que se encuentran el dióxido de carbono. Sin embargo, de acuerdo al esquema de clasificación general propuesto por (33) solamente el grupo B (6 cepas) se caracteriza como Lactobacillus. Los aislados restantes Lactobacillus (A, C, D, E) presentan características diferentes pese a que son BAL, por lo que las respuestas a estos ensayos no son concluyentes para la identificación de especie sin embargo se debe destacar la diversidad de bacterias lácticas presentes en el queso de hoja ecuatoriano.

En cuanto a los Lactococcus (Grupo F) de acuerdo a (34) presentan las características propias de este género, pudiendo pertenecer a Enterococcus. Dentro de las BAL también los géneros Tetragenococcus y Aerococcus, se desarrollan a pH 9.6.
Aparte de las características descritas para Enterococcus: crecimiento a 10 °C y 45 °C, en 6.5 % de NaCl y a pH 9.6, su sobrevivencia después de calentamiento a 60 °C durante 30 minutos asegura la correspondencia a este género, en esta ocasión no se realizó dicho ensayo in vitro, sin embargo, se evidencia la tolerancia de aislados de BAL a dicha temperatura ya que durante el procesamiento se realiza el estiramiento de la pasta a 70 ºC.

5. CONCLUSIONES

La evaluación microbiológica comparativa de los quesos de hoja artesanales e industriales, mediante niveles de indicadores de higiene, superan los límites de aceptabilidad descritos en la normativa ecuatoriana, sugiriendo pobre calidad higiénica de los procesos, del entorno o incorrecta manipulación de la leche; para reducir estos niveles es necesario mejorar la aplicación de las correctas prácticas de higiene tal como lo establecen los programas del sistema HACCP. Adicionalmente la intensidad del tratamiento térmico aplicado afecta a los niveles poblacionales de BAL en los dos tipos de quesos examinados.

El queso de hoja artesanal es potencial fuente de BAL indígenas, a partir de las cuales se pueden preparar cultivos iniciadores y no iniciadores que diversifiquen el flavour y aroma de los quesos elaborados industrialmente.

Sin duda, el queso de hoja elaborado artesanalmente requiere mejoras en el aspecto higiénico e innovación a fin de garantizar su calidad e inocuidad, sin pérdida de sus características sensoriales típicas que lo identifican como un elemento representante de la gastronomía ecuatoriana-española y un atractivo turístico de Latacunga, Ecuador.

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DECLARACIÓN DE TRANSPARENCIA

Los autores de este manuscrito declaran no tener ningún tipo de conflicto de intereses.