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ANALESRANFwww.analesranf.com%u2022 CD8a (Alexa Fluor%u00ae 488, clon 53-6.7),%u2022 CD4 (Brilliant Violet 510%u2122, clon GK1.5),%u2022 CD3 (PerCP/Cy5.5, clon 17A2), todos deBiolegend.Tras dos lavados adicionales, las c%u00e9lulas sefijaron y permeabilizaron usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), seg%u00fan las instrucciones del fabricante. Luego se ti%u00f1erondurante 30 minutos sobre hielo para las citoquinas intracelulares:%u2022 TNF-a (Brilliant Violet 421%u2122, clon MP6-XT22),%u2022 IFN-g (Alexa Fluor%u00ae 647, clon XMG1.2),%u2022 IL-2 (Brilliant Violet 785%u2122, Biolegend).Finalmente, las c%u00e9lulas se lavaron seg%u00fan elprotocolo del kit, se resuspendieron en tamp%u00f3n de tinci%u00f3n y se adquirieron en un cit%u00f3metro FACSCelestaSORP (BD Biosciences). Elan%u00e1lisis de datos se realiz%u00f3 con el softwareFlowJo (BD Biosciences).2.4.5 Mantenimiento del SaRS-Cov-2 y desaf%u00edo infecciosoLa l%u00ednea celular Calu-3 se cultiv%u00f3 en medioDMEM suplementado con un 20% de suero fetalbovino inactivado por calor (HIFBS) y 10 mM deHEPES. Esta l%u00ednea celular fue proporcionadaamablemente por el Dr. Luis Enjuanes (CNBCSIC, Madrid, Espa%u00f1a) y se utiliz%u00f3 para la propagaci%u00f3n viral a una multiplicidad de infecci%u00f3n(MOI) de 0,001 unidades formadoras de placa(PFU) por c%u00e9lula. El sobrenadante se recogi%u00f3 alas 72 horas postinfecci%u00f3n (hpi), se someti%u00f3 atres ciclos de congelaci%u00f3n/descongelaci%u00f3n y seclarific%u00f3 por centrifugaci%u00f3n a 1.970 %u00d7g durante10 minutos. El virus fue titulado y almacenadoa %u201380 %u00b0C hasta su uso. La titulaci%u00f3n se realiz%u00f3utilizando la l%u00ednea celular Vero E6 (CRL-1586,ATCC%u00ae, Manassas, VA), mantenida en medioDMEM suplementado con 5% de HIFBS. La adsorci%u00f3n viral se permiti%u00f3 durante 1 hora sobremonocapas de c%u00e9lulas Vero E6 en estado deconfluencia del 70%u201380%. Luego se a%u00f1adieron2 mL de agar semis%u00f3lido al 0,5% en medioDMEM suplementado con 2% de HIFBS. El recuento de unidades formadoras de placa (PFU)2.4.3 ElISpotLos ensayos ELISpot se realizaron utilizando elkit Murine IFN-%u03b3 ELISpot (Abcam, ReinoUnido), siguiendo las instrucciones del fabricante. En la fase de estimulaci%u00f3n, se sembraron 2 %u00d7 10%u2075 esplenocitos en 200 %u03bcL de medio deproliferaci%u00f3n con el est%u00edmulo correspondiente.La estimulaci%u00f3n se realiz%u00f3 por triplicado, incubando 20 horas a 37 %u00b0C y 5% de CO%u2082. Los est%u00edmulos empleados fueron:%u2022 Concanavalina A (1 %u03bcg/mL) como controlpositivo (Sigma-Aldrich),%u2022 Una mezcla equimolar de p%u00e9ptidos representando la secuencia completa de la prote%u00edna S (25 %u03bcg/mL), preparada a partir dePepTivator%u00ae SARS-CoV-2 Prot_S1 y Prot_S(Miltenyi Biotec, Alemania),%u2022 Una mezcla equimolar de p%u00e9ptidos representando la prote%u00edna N completa(25 %u03bcg/mL), a partir de PepTivator%u00ae SARSCoV-2 Prot_N (Miltenyi Biotec).2.4.4 tinci%u00f3n intracelular de citoquinas (citometr%u00eda de flujo)Los esplenocitos se sembraron en placas decultivo de 96 pocillos (1 %u00d7 10%u2076 c%u00e9lulas/pocillo)y se estimularon con el pool de p%u00e9ptidos de laprote%u00edna S (25 %u03bcg/mL, Miltenyi Biotec), o conPMA (50 ng/mL) e ionomicina (1 %u03bcg/mL) comocontrol positivo (Sigma-Aldrich). El grupo negativo no recibi%u00f3 est%u00edmulo.Durante la estimulaci%u00f3n se a%u00f1adieron:%u2022 Brefeldina A (5 %u03bcg/mL),%u2022 Monensina (2 mM),%u2022 Anticuerpo anti-CD107a (1 %u03bcg/mL; PE antimouse CD107a, clon 1D4B, Biolegend).Las c%u00e9lulas se incubaron durante 4 horas adicionales a 37 %u00b0C, en atm%u00f3sfera humidificadacon 5% CO%u2082. Posteriormente se lavaron conPBS y se ti%u00f1eron con el marcador de viabilidadLIVE/DEAD%u2122 Fixable Near-IR (Thermo Fisher)durante 20 minutos sobre hielo. Luego se lavaron con tamp%u00f3n de tinci%u00f3n (PBS + 2% HIFBS+ 0,02% azida s%u00f3dica) y se ti%u00f1eron los marcadores de superficie con los siguientes anticuerpos anti rat%u00f3n, conjugados con fluor%u00f3foros:179 La vacuna no replicativa de ADN, pPAL-S + pPAL-N,libre de genes de resistencia a antibi%u00f3ticos, confiereprotecci%u00f3n completa en ratones frente al SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.an. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba 2 (2025) %u00b7 pp.