Page 58 - Demo

tham, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la detecci%u00f3n del ARN viral, sellev%u00f3 a cabo una PCR cuantitativa en dos pasos(qRT-PCR) utilizando transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen) y ADN polimerasa EHF(Roche, Basilea, Suiza), siguiendo el protocolode Toussaint et al. (18).Se emplearon los siguientes cebadores ysonda espec%u00edficos para el gen N del SARS-CoV2:%u2022 N1-F: GACCCCAAAATCAGCGAAAT%u2022 N1-R: TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG%u2022 N1-P (sonda): FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1Como gen de referencia (%u03b2-actina), se utilizaron:%u2022 ACT_F_1005-1029: CAGCACAATGAAGATCAAGATCATC%u2022 ACT_R_1135-1114:CGGACTCATCGTACTCCTGCTT%u2022 ACT_P_1081-1105: JOE-TCGCTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-BHQ1Los mismos sobrenadantes clarificados delos %u00f3rganos se emplearon para determinar lareplicaci%u00f3n viral mediante ensayos de placasen c%u00e9lulas Vero, expres%u00e1ndose los resultadoscomo PFU por gramo de tejido.2.4.8 an%u00e1lisis estad%u00edsticoPara los experimentos de tinci%u00f3n intracelularde citoquinas, se utiliz%u00f3 ANOVA de dos factorescon prueba post-hoc de Fisher (Least Difference). En todos los dem%u00e1s experimentos, seaplic%u00f3 la prueba t de Student, ajustando losvalores de p mediante el m%u00e9todo de HolmSidak.3. RESUltadoS3.1 las c%u00e9lulas HEK293 transfectadas con lavacuna candidata pPal-Sfs + pPal-N expresan los genes Sfs y N de SaRS-Cov-2Las secuencias g%u00e9nicas de las prote%u00ednas S y Nse obtuvieron del genoma del aislado Wuhan1 de SARS-CoV-2 (GenBank Acc. No.se realiz%u00f3 tras 6 d%u00edas de incubaci%u00f3n. Los ratones fueron desafiados con 10%u2075 PFU de las cepasMAD6 o Delta de SARS-CoV-2 por v%u00eda intranasal, 15 d%u00edas despu%u00e9s de la dosis de refuerzo. Apartir de entonces, se monitoriz%u00f3 diariamenteel peso corporal y el estado cl%u00ednico de los animales.El seguimiento del peso y del estado cl%u00ednicose realiz%u00f3 en grupos de 10 ratones K18-hACE2por condici%u00f3n experimental (grupo controlpPAL y grupo vacunado pPAL-Sfs + pPAL-N). El%u00edndice cl%u00ednico se calcul%u00f3 seg%u00fan los criterios especificados en la Tabla Suplementaria 1. Parala evaluaci%u00f3n de la carga viral, se emplearon20 ratones por grupo en cada experimento,distribuidos en subgrupos de cinco individuos,sacrificados en los d%u00edas 2, 4, 7 y 14 tras el desaf%u00edo.2.4.6 Evaluaci%u00f3n del estado cl%u00ednicoLos ratones fueron observados y pesados diariamente tras el desaf%u00edo v%u00edrico. Los signos cl%u00ednicos se puntuaron seg%u00fan los criteriosrecogidos en la Tabla S1. La puntuaci%u00f3n total(sumatoria) de los signos cl%u00ednicos %u2014que incluyepeso corporal, aspecto, movilidad y respiraci%u00f3n%u2014 se utiliz%u00f3 como indicador de la gravedadde la enfermedad. Se estableci%u00f3 un criterio definalizaci%u00f3n humanitaria (eutanasia) cuandoesta puntuaci%u00f3n superaba el valor de 50, conel objetivo de minimizar el sufrimiento animal.2.4.7 Evaluaci%u00f3n de la carga viral en %u00f3rganosdianaSe obtuvieron muestras de los %u00f3rganos diana(pulm%u00f3n, coraz%u00f3n y cerebro) en los d%u00edas 2, 4,7 y 14 tras el desaf%u00edo. Estas muestras fueronsometidas a tres ciclos de congelaci%u00f3n/descongelaci%u00f3n, seguidos de 20 ciclos de sonicaci%u00f3n por minuto a 5 W durante 2 minutos. Loslisados se centrifugaron a 220 %u00d7g durante 5 minutos para obtener sobrenadantes virales clarificados. La extracci%u00f3n de ARN total se realiz%u00f3utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Wal180ANALESRANFwww.analesranf.coman. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 173-192The non-replicative DNA vaccine, pPAL-S + pPAL-N,free of antibiotic resistance genes, confers completeprotection in mice against SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.