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de sueros de rat%u00f3n previamente inactivadospor calor (diluci%u00f3n inicial 1:10) y se incubaroncon 100 unidades formadoras de placas (PFU)del virus SARS-CoV-2 MAD6 o de la varianteDelta (B.1.617.2) durante 1 hora a 37 %u00b0C, enplacas de 96 pocillos de fondo plano. Posteriormente, se sembraron 2 %u00d7 10%u2074 c%u00e9lulas VeroE6 por pocillo sobre la mezcla de suero/virus,y se incubaron durante 3 d%u00edas a 37 %u00b0C con 5%de CO%u2082. Tras la incubaci%u00f3n, se retir%u00f3 el mediode cultivo y las c%u00e9lulas se fijaron con paraformaldeh%u00eddo al 2%. A continuaci%u00f3n, se ti%u00f1eroncon cristal violeta al 2%. Los t%u00edtulos de anticuerpos neutralizantes (NAb) se calcularoncomo la diluci%u00f3n del suero en la que se observ%u00f3 menos del 50% de efecto citop%u00e1tico enlos pocillos replicados.2. 4. 2 Ensayos ElISpot y tinci%u00f3n intracelularde citoquinasSe obtuvieron suspensiones de esplenocitosen 15 mL de PBS conteniendo 0,3 mM de EDTAy 2% de suero fetal bovino inactivado por calor(HIFBS), utilizando filtros celulares de 0,45 %u03bcm(BD Falcon Cell Strainers, BD Biosciences, SanJos%u00e9, CA). Las c%u00e9lulas se recolectaron por centrifugaci%u00f3n a 500 %u00d7g durante 7 minutos, y loseritrocitos se lisaron a temperatura ambientedurante 2 minutos con 5 mL de tamp%u00f3n de lisisde eritrocitos (1X RBC Lysis Buffer, pluriSelectLife Science, Leipzig, Alemania). A continuaci%u00f3n, se a%u00f1adieron inmediatamente 25 mL desoluci%u00f3n de lavado y se centrifug%u00f3 nuevamentea 500 %u00d7g durante 7 minutos. Tras un lavadoadicional, las c%u00e9lulas se resuspendieron en5 mL de medio de proliferaci%u00f3n (RPMI suplementado con 10% HIFBS, 100 UI de penicilina %u2013100 %u03bcg/mL de estreptomicina y 4,5 %u03bcM de %u03b2mercaptoetanol). Las suspensiones se filtraronnuevamente mediante filtros de 0,45 %u03bcm, y sediluy%u00f3 una al%u00edcuota 1:1 con azul tripano al0,4% (Sigma-Aldrich) para el recuento de c%u00e9lulas viables, usando portaobjetos TC10 y uncontador autom%u00e1tico TC10 (BioRad).utilizaci%u00f3n. Se prepararon diluciones seriadas1:3 de los sueros en PBS con 0,05% de Tween20 y 1% de alb%u00famina s%u00e9rica bovina (BSA). Serecubrieron placas de microtitulaci%u00f3n de 96pocillos de fondo plano con 50 %u03bcL de prote%u00ednarecombinante S1+S2 ECD-His (Sino Biological,Beijing, China) y RBD (RayBiotech Life, Peachtree Corners, GA), a una concentraci%u00f3n de50 %u03bcg/mL en tamp%u00f3n carbonato-bicarbonato(3,36 mM/10 mM), incub%u00e1ndose a 4 %u00b0C durante16 horas. Tras tres lavados con PBS-Tween0,05% + 1% BSA, se bloque%u00f3 la placa con PBSTween 0,05% conteniendo 3% de BSA durante1 hora a temperatura ambiente. Luego, se repitieron los lavados y se a%u00f1adieron 100 %u03bcL delas muestras de suero diluidas, incubando durante 1 hora.Despu%u00e9s de los lavados, se incub%u00f3 con unode los siguientes conjugados con HRP durante1 hora:%u2022 Prote%u00edna A conjugada a HRP diluida1:8.000 (Invitrogen, Waltham, MA)%u2022 Anticuerpo IgG1 de cabra anti-rat%u00f3n diluido 1:20.000%u2022 Anticuerpo IgG2c de cabra anti-rat%u00f3n diluido 1:20.000 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)Posteriormente se realizaron tres lavados finales. El desarrollo de color se llev%u00f3 a caboutilizando el kit TMB Substrate (Thermo Scientific, Waltham, MA), incubando 100 %u03bcL durante10 minutos. La reacci%u00f3n se detuvo a%u00f1adiendo100 %u03bcL de H%u2082SO%u2084 2 N. La absorbancia a 450 nm(A450) se midi%u00f3 con un lector Microplate Reader 680 (BioRad, Hercules, CA) y el softwareMicroplate Manager 5.2.1 (BioRad).2.4.1 Ensayos de neutralizaci%u00f3n de SaRS-Cov-2La cepa viral MAD6 de SARS-CoV-2 y la varianteB.1.617.2 (Delta) fueron gentilmente proporcionadas por el Dr. Luis Enjuanes y el Dr. JuanFrancisco Garc%u00eda-Arriaza (CNB-CSIC, Madrid,Espa%u00f1a), respectivamente. La secuencia gen%u00f3mica de la cepa MAD6 es id%u00e9ntica a la del aislado original Wuhan-Hu-1 (GenBankMN908947). Se prepararon diluciones seriadas178ANALESRANFwww.analesranf.coman. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 173-192The non-replicative DNA vaccine, pPAL-S + pPAL-N,free of antibiotic resistance genes, confers completeprotection in mice against SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.