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176ANALESRANFwww.analesranf.coman. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 173-192The non-replicative DNA vaccine, pPAL-S + pPAL-N,free of antibiotic resistance genes, confers completeprotection in mice against SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.La selecci%u00f3n se realiz%u00f3 en medio LB-agar suplementado con triclos%u00e1n a 3 %u03bcM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). El pl%u00e1smidopGH fue eliminado mediante digesti%u00f3n con laenzima KpnI (NEB, Ipswich, MA), y los constructos vacunales se circularizaron utilizandoligasa T4 (NEB). Las preparaciones libres deendotoxinas de los pl%u00e1smidos pPAL, pPAL-Sfs ypPAL-N se obtuvieron con el kit PureLink%u2122 ExpiEndotoxin-Free Giga Plasmid Purification Kit(Invitrogen, Waltham, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante.2.2 Expresi%u00f3n g%u00e9nica de ant%u00edgenos en c%u00e9lulasHEK293 transfectadasLas c%u00e9lulas HEK293 (CRL-1573%u2122, ATCC%u00ae, Manassas, VA) se cultivaron a 37 %u00b0C en una atm%u00f3sfera con 5% de CO%u2082 en medio completo (CM),compuesto por DMEM suplementado con un10% de suero fetal bovino inactivado por calor(HIFBS, Sigma-Aldrich, Burlington, MA), 100 UIde penicilina y 100 %u00b5g/mL de estreptomicina.Las c%u00e9lulas en estado de semiconfluencia fueron desprendidas por pipeteo suave, lavadasuna vez con 1 mL de PBS est%u00e9ril y una vez con0,3 mL de GTporator%u00ae-M (Protean, Rep%u00fablicaCheca) por cada 3 %u00d7 10%u2076 c%u00e9lulas. Posteriormente, se transfectaron por electroporaci%u00f3ncon los pl%u00e1smidos pPAL, pPAL-S, pPAL-Sfs opPAL-N. Se incluy%u00f3 un control de transfecci%u00f3nsin ADN. Se transfectaron 1,2 %u00d7 10%u2076 c%u00e9lulas con5 %u00b5g de ADN en 80 %u00b5L de soluci%u00f3n GTporator%u00ae-M, utilizando una cubeta est%u00e9ril con un espacio de 2 mm (BTX, Cambridge, Reino Unido) yun equipo ECM 630 Electro Cell ManipulatorPrecision Plus%u00ae (BTX). nmediatamente se a%u00f1adieron 1,2 mL de medio precalentado. Se sembraron 0,2 mL de la suspensi%u00f3n celular en unaporta de 8 pocillos (Nunc%u00ae Lab-Tek%u00ae, SigmaAldrich) y 1 mL en una placa de 24 pocillos. Lasc%u00e9lulas se incubaron 24 h a 37 %u00b0C y 5% CO%u2082.Las c%u00e9lulas transfectadas en placas de 24pocillos se lavaron dos veces con 1 mL de CM yse lisaron con 50 %u03bcL de tamp%u00f3n (25 mM Tris-HClpH 7,8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% glicerol, 1%Triton-X100). Las prote%u00ednas se cuantificaronpor el m%u00e9todo de Bradford. Cada extracto(20 %u03bcg) fue tratado con 8,3 U/%u03bcL de TurboNuclease (Serratia marcescens, Sigma-Aldrich)durante 10 min a temperatura ambiente.Luego se prepararon para electroforesis SDSPAGE en tamp%u00f3n Laemmli, calentados a 95 %u00b0Cdurante 5 min, y corridos a 30 mA durante90 min en geles TGX pre-ensamblados al 8-20%(BioRad).Las prote%u00ednas fueron transferidas porm%u00e9todo semiseco a membranas de nitrocelulosa de 0,45 %u03bcm (BioRad) a 1,3 A y 25 V durante10 min, utilizando el sistema TransBlot Turbo.Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% en PBS-Tween 0,1% a temperatura ambiente durante 1 h, bajo agitaci%u00f3nsuave, y se lavaron tres veces. Luego, se incubaron 90 min con anticuerpos primarios entamp%u00f3n de bloqueo: anti-SARS-CoV-2 S (subunidad S2, Abcam ab272504) a 1:750, y anti-N(cortes%u00eda de Mercedes Dom%u00ednguez e Inmaculada Moreno, CNM-ISCIII) a 1:500. Tras los lavados, se incub%u00f3 1 h con anticuerpo secundarioHRP-conjugados con anti-IgG de cabra antirat%u00f3n (DAKO Agilent) a 1:2.000. La detecci%u00f3npor quimioluminiscencia se realiz%u00f3 con ECLWestern Blotting Reagent (Thermo Fisher) durante 1 min. Las im%u00e1genes se adquirieron conel sistema ChemiDoc MP (BioRad) y se analizaron en ImageLab 6.1 (BioRad).Las c%u00e9lulas en portas de 8 pocillos se lavaroncon 200 %u03bcL de soluci%u00f3n hipot%u00f3nica(agua:DMEM, 11:9) y dos veces conacetona:metanol (1:1). Se fijaron y permeabilizaron con acetona:metanol (1:1) a %u201320 %u00b0C durante 10 min, se secaron al aire y se retiraronlos pocillos. Se realizaron tres lavados de5 min con PBS filtrado (0,22 %u03bcm), se secaron alaire y se bloquearon con 20 %u03bcL de leche desnatada al 5% en PBS-Tween, durante 1 h a37 %u00b0C en c%u00e1mara h%u00fameda. Despu%u00e9s del bloqueo, se a%u00f1adieron 20 %u03bcL de los anticuerposanti-S2 y anti-N diluidos 1:50, y se incubaron1 h. Tras un lavado de 5 min, se incubaron con20 %u03bcL de anticuerpo secundario Alexa Fluor%u00ae488 anti-IgG de cabra (1:200) durante 1 h enoscuridad. A los 50 min de esta incubaci%u00f3n, sea%u00f1adieron 20 %u03bcL de DAPI (10 %u03bcg/mL).