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ANALESRANFwww.analesranf.comviral, se aplic%u00f3 eutanasia inmediata si se detectaba una p%u00e9rdida de peso igual o superioral 20%, o cualquier signo incipiente de sufrimiento. Los procedimientos empleados en losexperimentos de desaf%u00edo fueron posteriormente evaluados de forma retrospectiva.Los ratones C57BL/6J y K18-hACE2 fueroninmunizados por v%u00eda intramuscular (IM) con lavacuna pPAL-Sfs + pPAL-N, compuesta por ADNlibre de endotoxinas (20 %u03bcg de pPAL-Sfs y 20 %u03bcgde pPAL-N) disuelto en agua est%u00e9ril CHROMASOLV%u2122 (Honeywell Riedel-de Ha%u00ebn, Charlotte,NC). Los ratones control recibieron 40 %u03bcg depPAL vac%u00edo.La electroporaci%u00f3n se realiz%u00f3 utilizando doselectrodos tipo aguja de 30G (0,3 %u00d7 13 mm),conectados a un sistema de electroporaci%u00f3nECM 830 Square Wave (BTX, Harvard Bioscience Inc.). Las agujas se colocaron equidistantes al punto de inyecci%u00f3n, siguiendo ladirecci%u00f3n de las fibras musculares, con una separaci%u00f3n aproximada de 5 mm. El polo negativo se situ%u00f3 en posici%u00f3n posterior. Se aplicaronseis pulsos de 100 V, de 50 ms cada uno, a intervalos de 1 segundo. Los animales fueron inmovilizados sobre una superficieel%u00e9ctricamente aislada y se mantuvieron bajoanestesia con isofluorano (3% inducci%u00f3n, 2,5%mantenimiento) durante todo el procedimiento. Posteriormente, se administr%u00f3 ibuprofeno en el agua a 0,2 mg/kg. Los ratonesC57BL/6J fueron sacrificados una semana despu%u00e9s de la dosis de refuerzo para evaluar larespuesta inmune celular en el bazo. Los ratones K18-hACE2 fueron desafiados con elvirus dos semanas despu%u00e9s de la dosis de refuerzo, tras evaluar la respuesta inmune humoral.2.4 ElISaSe recogieron 100 %u03bcL de sangre perif%u00e9rica a losratones una semana antes de la vacunaci%u00f3n y15 d%u00edas despu%u00e9s de la misma. La sangre se dej%u00f3coagular a 4 %u00b0C durante 5 horas. El suero seobtuvo por centrifugaci%u00f3n a 8.000 %u00d7g durante10 minutos y se almacen%u00f3 a %u201320 %u00b0C hasta su177 an. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba 2 (2025) %u00b7 pp. 173-192Finalmente, se realizaron cuatro lavados de5 min con PBS filtrado, se montaron con 50 %u03bcLde Mowiol 4-88 y se dejaron secar a 4 %u00b0C durante 16 h en oscuridad. Las im%u00e1genes de fluorescencia se adquirieron con un microscopioconfocal SP8 STED 3X (Leica, Alemania).2.3 Inmunizaci%u00f3n con pPal-Sfs + pPal-NSe utilizaron 87 ratones hembra C57BL/6J detipo salvaje, de ocho semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA), para el an%u00e1lisis dela respuesta inmune, y 140 ratones hembratransg%u00e9nicos B6Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)para los experimentos de protecci%u00f3n.Los animales fueron alojados, por norma general, en grupos de cinco, excepto en el casode cuatro grupos de ocho ratones C57BL/6J enel experimento de dosis-respuesta. En todomomento se cumplieron los requisitos de espacio establecidos por la legislaci%u00f3n vigente(Directiva 2010/63/UE y el Real Decreto53/2013, modificado por el RD 1386/2018).Los permisos necesarios fueron aprobados porel Comit%u00e9 de %u00c9tica del Consejo Superior de Investigaciones Cient%u00edficas (CSIC) y la Comunidad Aut%u00f3noma de Madrid.Los experimentos con ratones infectados serealizaron en laboratorios de bioseguridadnivel 3+ (BSL3+, CISA-INIA-CSIC). Todos los animales recibieron alimentaci%u00f3n y agua ad libitum. Se aplicaron medidas de bienestaranimal, siguiendo los principios de reemplazo,reducci%u00f3n y refinamiento. Tambi%u00e9n se implementaron medidas de enriquecimiento ambiental.Durante la administraci%u00f3n de la vacuna y laelectroporaci%u00f3n in vivo, se aplic%u00f3 anestesiacon isofluorano (3% para inducci%u00f3n, 2,5% paramantenimiento). Adem%u00e1s, se a%u00f1adi%u00f3 ibuprofeno al agua de bebida a una dosis de 0,2mg/kg tras el procedimiento. Para la eutanasia, tambi%u00e9n se utiliz%u00f3 isofluorano seguido depunci%u00f3n intracard%u00edaca. Se aplicaron todas lasmedidas adicionales exigidas por la normativa.En los ratones K18-hACE2 sometidos al desaf%u00edoLa vacuna no replicativa de ADN, pPAL-S + pPAL-N,libre de genes de resistencia a antibi%u00f3ticos, confiereprotecci%u00f3n completa en ratones frente al SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.