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ANALESRANFwww.analesranf.commedia fue mucho menor (%u2248200 SFC/mill%u00f3n) (Figura 3A). Un segundo ensayo ELISpot independiente confirm%u00f3 los altos niveles deproducci%u00f3n de IFN-g y mostr%u00f3 una respuestadosis-dependiente con >2.000, %u22481.500, %u22481.300y 0 SFC/mill%u00f3n tras inmunizaci%u00f3n con 20, 10,5 y 1 %u03bcg de cada pl%u00e1smido, respectivamente(Figura 3B).Mediante citometr%u00eda de flujo con tinci%u00f3n intracelular de citoquinas (ICS), se evalu%u00f3 la activaci%u00f3n de linfocitos CD4%u207a y CD8%u207a frente a lospools de p%u00e9ptidos de S y N. Todos los ratonesvacunados produjeron linfocitos CD4%u207a y CD8%u207aespec%u00edficos para S y N (Figura 4A). Se observaron c%u00e9lulas activadas positivas para CD107a,IFN-g, IL-2 y TNF-a, excepto IL-2 en CD8%u207afrente a N (Figura 4B). La activaci%u00f3n frente aN fue inferior, salvo CD107a en CD4%u207a. No se detect%u00f3 activaci%u00f3n para IFN-g ni IL-2 frente a N.primovacunaci%u00f3n/refuerzo con un intervalo de15 d%u00edas e incluyendo electroporaci%u00f3n in vivo.Los t%u00edtulos promedio de IgG anti-S, IgG antiRBD e IgG2c anti-RBD superaron los 2.000. Laraz%u00f3n IgG2c/IgG1 fue aproximadamente 750en los ratones vacunados (Figura 2A). Todos losanimales vacunados presentaron anticuerposneutralizantes (NAb), con t%u00edtulos promedio entorno a 100 tras la dosis de refuerzo (Figura2B).En el ensayo ELISpot, todos los ratones vacunados presentaron m%u00e1s de 500 colonias formadoras de Spot Forming Colonies (SFC)productoras de IFN-g por mill%u00f3n de esplenocitos al d%u00eda 7 tras el refuerzo, espec%u00edficamentefrente a un pool de p%u00e9ptidos de 11 residuos solapados que cubre toda la prote%u00edna S del virus.El promedio fue de %u22481.600, con un m%u00e1ximo de%u22483.100 (Figura 3A). Frente a la prote%u00edna N, la183 an. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba 2 (2025) %u00b7 pp. 173-192La vacuna no replicativa de ADN, pPAL-S + pPAL-N,libre de genes de resistencia a antibi%u00f3ticos, confiereprotecci%u00f3n completa en ratones frente al SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.Figura 3. la activaci%u00f3n espec%u00edfica de S y N de los esplenocitos productores de IFN-g inducida por el candidato vacunal pPal-Sfs +pPal-N en ratones C57bl/6J depende de la dosis. los esplenocitos se obtuvieron 7 d%u00edas despu%u00e9s del refuerzo despu%u00e9s de lainoculaci%u00f3n de pPal y pPal-Sfs + pPal-N. los esplenocitos (2x105 c%u00e9lulas/pocillo) se estimularon a 37 %u00baC en placas ElISpot de IFN-( durante 16 h con grupos de p%u00e9ptidos superpuestos de 8 amino%u00e1cidos de 11-mer (25 %u03bcg/pocillo) que representan todas las secuenciasde amino%u00e1cidos S y N en cantidades equimolares. los controles de estimulaci%u00f3n negativos se restaron de los valores de SFC pormill%u00f3n de c%u00e9lulas. la inferencia estad%u00edstica se realiz%u00f3 mediante la prueba t de Student aplicando el ajuste del valor p por el m%u00e9todode Holm-Sidak (( = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). (a) Se observa una fuerte activaci%u00f3n espec%u00edfica de S y N de los esplenocitosproductores de IFN- con un r%u00e9gimen de inmunizaci%u00f3n de cebado/refuerzo con pPal-Sfs + pPal-N. (b) la activaci%u00f3n espec%u00edfica de Sde los esplenocitos productores de IFN- con pPal-Sfs + pPal-N depende de la dosis.