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2. MatERIalES y M%u00e9todoS2.1 Construcci%u00f3n pPalLas vacunas de ADN requieren un vector quepermita la replicaci%u00f3n de los genes y la expresi%u00f3n de los ant%u00edgenos codificados. Habitualmente, se emplean genes de resistencia aantibi%u00f3ticos como marcadores de selecci%u00f3n, loscuales no deben ser liberados al medio ambiente tras la comercializaci%u00f3n del productofinal. Por tanto, el uso de vectores libres degenes de resistencia a antibi%u00f3ticos es imprescindible.El pl%u00e1smido de expresi%u00f3n en mam%u00edferos pPALest%u00e1 basado en las secuencias potenciadora ypromotora del citomegalovirus (CMV). Estepl%u00e1smido no se replica en c%u00e9lulas de mam%u00edferoy no contiene marcadores de selecci%u00f3n basadosen resistencia a antibi%u00f3ticos. En su lugar, utiliza como marcador de selecci%u00f3n el gen fabI deE. coli, que codifica para la enzima enoil-ACPreductasa. Esta enzima es inhibida por el compuesto bacteriost%u00e1tico triclos%u00e1n, empleadocomo agente selectivo a una concentraci%u00f3n %u00f3ptima de 3 %u03bcM. El constructo pPAL-Sfs (Figura1A) contiene una versi%u00f3n modificada del genque codifica la prote%u00edna S del SARS-CoV-2, correspondiente al n%u00famero de acceso NCBINC045512, ID de gen 43740568. En primerlugar, la secuencia fue optimizada mediante unenfoque Monte Carlo basado en las frecuenciasrelativas de uso de codones. En segundo lugar,se modific%u00f3 el sitio de corte por furina (PRRA%u2192 PGGS; residuos 681-684). Para ello, la secuencia nucleot%u00eddica CCTCGGCGGGCA fue sustituida por CCAGGCGGCAGC (posiciones2041%u20132052).El constructo pPAL-N contiene el gen de laprote%u00edna N del SARS-CoV-2 (tambi%u00e9n con n%u00famero de acceso NC045512, ID de gen43740575). Los constructos pPAL-Sfs y pPAL-N,flanqueados por sitios de restricci%u00f3n KpnI, fueron obtenidos por s%u00edntesis g%u00e9nica en el vectorpGH (ATG Biosynthetics, Merzhausen, Alemania) y transferidos a la cepa E. coli SURE2 (Agilent, Santa Clara, CA) medianteelectroporaci%u00f3n (1.800 V, 200 W, 25 %u03bcF)(FIG1B).ANALESRANFwww.analesranf.comHemos desarrollado un nuevo candidato vacunal de ADN para prevenir la infecci%u00f3n porSARS-CoV-2, que incluye las secuencias completas de los genes de la prote%u00edna S y de la nucleoc%u00e1pside (N), clonadas en el pl%u00e1smido pPAL,un vector de expresi%u00f3n en mam%u00edferos no replicativo y libre de genes de resistencia a antibi%u00f3ticos. La secuencia del gen S ha sidomodificada para estabilizar la prote%u00edna resultante frente al corte por furina (Sfs) e incluyeel dominio RBD, responsable de la entrada delvirus en la c%u00e9lula hospedadora. El candidatovacunal pPAL-Sfs + pPAL-N se compone de unamezcla en proporci%u00f3n 1:1 en masa de ambospl%u00e1smidos disueltos en agua est%u00e9ril. Se opt%u00f3por mantener los genes en pl%u00e1smidos separados para evitar un pl%u00e1smido de mayor tama%u00f1o,lo que podr%u00eda reducir el rendimiento en la producci%u00f3n.El pl%u00e1smido pPAL contiene una isla CpG largay no requiere adyuvantes adicionales. La prote%u00edna N fue seleccionada debido a su altogrado de conservaci%u00f3n entre los betacoronavirus. Recientemente se ha propuesto un papelprotector para la prote%u00edna N frente a la infecci%u00f3n por SARS-CoV-2. Adem%u00e1s, esta prote%u00edna esla m%u00e1s abundante del virus, altamente inmunog%u00e9nica en infecciones por coronavirus ypuede contribuir a ampliar la respuesta de c%u00e9lulas T y mejorar la reactividad cruzada.Por tanto, evaluamos la eficacia del candidato vacunal pPAL-Sfs + pPAL-N frente a SARSCoV-2 mediante un r%u00e9gimen de inmunizaci%u00f3nde primovacunaci%u00f3n-refuerzo por v%u00eda intramuscular seguido de electroporaci%u00f3n in vivo.Se evaluaron las respuestas inmunes humoraly celular en ratones C57BL/6J de tipo salvaje,y el nivel de protecci%u00f3n frente a un desaf%u00edoletal con SARS-CoV-2 se valor%u00f3 en ratonestransg%u00e9nicos B6Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J.Este estudio demuestra que el candidato vacunal pPAL-Sfs + pPAL-N es una propuesta prometedora frente a la infecci%u00f3n porSARS-CoV-2.175 an. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba 2 (2025) %u00b7 pp. 173-192La vacuna no replicativa de ADN, pPAL-S + pPAL-N,libre de genes de resistencia a antibi%u00f3ticos, confiereprotecci%u00f3n completa en ratones frente al SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.