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dujo expresi%u00f3n de los ant%u00edgenos correspondientes, seg%u00fan se confirm%u00f3 mediante Westernblot (Figuras 1A, B). La inmunofluorescenciaindirecta utilizando anticuerpos policlonalesanti-S2 y anti-N tambi%u00e9n confirm%u00f3 la expresi%u00f3nde Sfs y N (Figuras 1C, D).3.2 la vacunaci%u00f3n con pPal-Sfs + pPal-N induce respuestas inmunes humorales y celulares espec%u00edficas frente a SaRS-Cov-2 enratonesRatones C57BL/6J (B6) fueron inmunizados porv%u00eda intramuscular con 20 %u03bcg de pPAL-Sfs y 20 %u03bcgde pPAL-N, siguiendo un esquema hom%u00f3logoMN908947). La variante Sfs es una versi%u00f3n mo-dificada del gen S, dise%u00f1ada para evitar el corte por furina (cambio en la secuencia: 2041 CCTCGGCGGGCA %u2192 CCAGGCGGCAGC; amino-%u00e1cidos 681 PRRA %u2192 PGGS). La furina end%u00f3gena de las c%u00e9lulas HEK293 hidroliza la glicoprote%u00edna S nativa, pero no Sfs, lo que se demuestra por la presencia del fragmento S2 solo en c%u00e9lulas transfectadas con pPAL-S (Figura 1A).Los genes Sfs y N fueron clonados por separado en el vector de expresi%u00f3n en mam%u00edferospPAL, bajo el control del potenciador/promotor del CMV, generando la vacuna candidatapPAL-Sfs + pPAL-N (Figura 1). La transfecci%u00f3nde c%u00e9lulas HEK293 con cada constructo pro182ANALESRANFwww.analesranf.coman. R. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 173-192The non-replicative DNA vaccine, pPAL-S + pPAL-N,free of antibiotic resistance genes, confers completeprotection in mice against SARS-CoV-2Pedro J. Alcolea, Jaime Larraga et al.Figura 2. las vacunas candidatas pPal-Sfs + pPal-N activan la inmunidad humoral espec%u00edfica del SaRS-Cov-2 S y Rbd enratones C57bl/6J. las muestras de suero se recogieron 15 d%u00edas despu%u00e9s de la dosis de refuerzo. (a) determinaciones deElISa de t%u00edtulos individuales y promedio de Igg anti-S y anti-Rbd circulante total determinados por ElISa utilizando prote%u00ednaa conjugada con HRP. determinaciones de ElISa de t%u00edtulos individuales y promedio de Igg, Igg1 e Igg2c circulantes antiRbd utilizando Igg1, anti-Igg2 y anti-Igg2c de cabra conjugada con HRP. los t%u00edtulos medios de Igg anti-S y anti-Rbd son1:2000. la relaci%u00f3n Igg2c/Igg1 es de 750 en los animales vacunados con respecto al grupo control de pPal. (b) El promediodel t%u00edtulo de anticuerpos neutralizantes es x100. la inferencia estad%u00edstica se realiz%u00f3 mediante la prueba t de Studentaplicando el ajuste del valor p por el m%u00e9todo de Holm-Sidak ( = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).