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RANF

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Tabla 1: Resumen de las concentraciones utilizadas en el trabajo junto con los criterios de sensibilidad y resistencia establecidos.

Fila1 ßA-(nlattiicpbtoáiómdtieiccoo) Abreviación máxima mínima Límite de
concentración2 concentración3 sensibilidad4

A (Apmenpiicciilliinnaa) AmP 8192 195,3x10-5 =8 >8

b (moAnzotrbeaocntáammico) Atm 1024 780x10-5 =1 >4

c (cceefaftlaozspidoirminaa) cAZ 2048 6,1x10-5 =1 >4

D (cecfeafltorisapxoorninaa) crO 512 12,2x10-5 =1 >2

e (cecfeaflootsapxoimrinaa) ctX 512 12,2x10-5 =1 >2

F (cecfeafluorsopxoimrinaa) cXm 8192 6.1x10-5 =8 >8

G (cecfaelfoesppiomraina) FeP 64 24,4x10-5 =1 >4

H (caImrbiappeenneemm) ImP 512 12,2x10-5 =2 >8

1 se índica la fila que corresponde a cada fila de la placa m-96.
2 y 3 Indica la concentración máxima (2) y mínima (3) en µg/mL de inhibidor utilizada en cada caso
4 se indican (en µg/mL) las concentraciones de antibiótico por debajo de la cual (izquierda) o por encima de la cual (derecha) se considera que una población de E. coli
es sensible o resistente, respectivamente, a un antibiótico.

los antibióticos utilizados en el estudio. La concentración de cada Para hallar las concentraciones máxima y mínima utilizadas,
antibiótico en el tubo es igual al doble de la concentración máxima inicialmente se realizó un experimento en el que se usaron las mismas
utilizada en el ensayo (tablas A2-A8). en el pocillo duodécimo de concentraciones de antibiótico en cada una de las placas correspon-
cada fila de la placa m-96 se añaden 200 µL del tubo eppendorf diente a cada ß-lactamasa. A partir de estos datos, se pudieron ajustar
que contiene el antibiótico correspondiente (tabla 1). A partir del las concentraciones adecuadas de cada antibiótico para calcular de
último pocillo de cada fila de la m96 se realizaron diluciones seria- manera fiable, a cada ß-lactamasas, los valores de inhibición de cre-
das añadiendo a cada pocillo 200 µL del pocillo anterior hasta el cimiento. Las concentraciones finales de cada fármaco utilizadas en
segundo pocillo de cada fila. De este modo, el primer pocillo de cada cada caso se indican en el Anexo (tablas A2-A8).
fila se utiliza como control positivo de crecimiento bacteriano en
ausencia de antibiótico. se incuba la placa m-96 a 30 ºc con airea- 3.2. Comprobación del sistema biológico escogido para
ción durante 20-22h. y transcurrido este periodo, se mide la absor- analizar las ß-lactamasas ancestrales
bancia de cada pocillo a una longitud de onda de 600 nm para
determinar el crecimiento bacteriano. Para comprobar la resistencia de un gen ancestral ya
caracterizado, se ha decidido medir los valores de MICs del gen
De acuerdo con el Dr. barry Hall y la literatura consultada reconstruido GncA frente a los 8 antibióticos utilizados en este
(36, 37) se establecieron, para cada proteína recombinante, las con- ensayo. estos valores nos dan información de la actividad de este
centraciones máxima y mínima de cada uno de los antibióticos uti- gen expresado a partir del vector que se utiliza en nuestro estudio
lizados para medir la actividad hidrolítica (tabla 1). Además, se (el pAcse3), confirmando que el vector es viable y permite la
establecieron las concentraciones de fármaco a partir de las cuales funcionalidad de ß-lactamasas ancestrales. Asimismo, se calculan
se considera que E. coli es sensible o resistente al efecto antibiótico las MICs de bacterias E. Coli DH5e que carecen del plásmido pAces3,
(tabla 1). como control para verificar que las bacterias utilizadas no presentan

Reconstrucción ancestral de una b-lactamasa y comparativa 161

con sus homólogos actuales

Gonzalo Fernández Balaguer, Carmen Del Águila, Carolina Hurtado Marcos Y Rubén Agudo Torres
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº 2 (2021) · pp. 155 - 170