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cada una de las construcciones de interés, obteniendo así 9 transfor-
mantes diferentes que contenían en su interior el plásmido con el gen
de interés. estas bacterias se multiplicaron y una alícuota de cada una
de ellas se conservaron a -80 ºc en presencia glicerol al 20% para su
posterior uso. Asimismo, se comprobó mediante secuenciación la co-
rrecta estructura de cada una de las construcciones.
2.4 Puesta a punto del método para medir la funciona-
lidad de las ß-lactamasas seleccionadas
Para medir la actividad de las ß-lactamasas estudiadas
en este trabajo, se decidió utilizar el método de la mínima concen-
tración inhibitoria (MICs del inglés Minimal inhibitory concentra-
tions), utilizado históricamente para la detección de resistencia de
una bacteria ante un antibiótico (41). se utilizó una placa de 96 po-
cillos (m-96, 8 filas por 12 columnas) como soporte para medir la
resistencia de cada uno de las ß-lactamasa los 8 antibióticos utili-
zados en este estudio: ampicilina,aztreonam, cefotaxima, ceftazi-
dima, ceftriaxona, cefepima, cefuroxima e imipenem. se añadieron,
en cada una de las 8 filas de la placa, diferentes concentraciones de
cada compuesto. Desde la columna 12 a la columna 2, la concen-
tración de antibiótico en cada uno de los pocillos fue la mitad de la
del pocillo anterior. De este modo, el segundo pocillo de cada fila
contendrá la mínima concentración de antibiótico y el último la má-
xima concentración de antibiótico. el primer pocillo de cada fila se
mantuvo libre de antibiótico y se utilizó como control negativo del
Figura 2: Plásmido pAcse3 utilizado para el clonaje de los genes utilizados en este estudio. se muestra muestra el sitio de policlonaje con las dianas de restricción
utilizadas (Bsp HI y Sac I), el gen de resistencia tet (en naranja) y la región lac (en verde).
Ancestral reconstruction of a b-lactamase and comparison with
160 its extant proteins
Gonzalo Fernández Balaguer, Carmen Del Águila, Carolina Hurtado Marcos y Rubén Agudo Torres
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº 2 (2021) · pp. 155 - 170
ANALES
RANF
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efecto inhibitorio de estos compuestos. Las concentraciones de anti-
biótico utilizadas en cada placa se indican en la sección correspon-
diente de resultados. Después de incubar la placa durante 20 horas
a 30 ºc, se midieron la densidad óptica (O.D.) de cada uno de los
pocillos utilizando un espectrofotómetro lector de placas FLuOstar®
Omega (bmG labtech) a una longitud de onda de 600 nm.
3. RESULTADOS
3.1. Puesta a punto del método para el análisis de las
secuencias ancestrales
el objetivo de este trabajo es medir y comparar la activi-
dad enzimática de varias ß-lactamasas frente a un grupo de anti-
bióticos. Asimismo, se decidió medir la concentración mínima de
antibiótico que era capaz de inhibir el crecimiento de cultivos de E.
coli que expresaban los genes recombinantes de ß-lactamasas. De
modo que en una única placa m-96 se analiza el efecto ß-lactámico
de una única enzima frente a 8 antibióticos diferentes. Para ello, se
crece un cultivo de bacterias transformadas con plásmidos que por-
taban el gen de interés en 10 mL medio müller-Hinton (m-H) du-
rante toda la noche a 37 ºc en presencia de 0.1 mm IPtG y 10
µg/mL de tet. esta incubación se realiza en tubos de 15 mL y ce-
rrados para limitar la aireación del cultivo. Al día siguiente, se diluye
el cultivo para que contenga una concentración de 5x105 unidades
formadoras de colonia (cFu) por mL. se añaden 200 µL de esta
disolución en cada uno de los pocillos de una placa m-96 y 500 µL en
8 tubos eppendorf. en cada tubo eppendorf se diluye cada uno de