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ANALES
RANF
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2.2 Obtención y selección de secuencias de ß-lactamasas
ancestrales
2.2.1 Selección de secuencias de ß-lactamasas actuales
Para este trabajo, se decidió estudiar la actividad hidrolí-
tica de 4 enzimas actuales [caracterizadas por ser ß-lactamasas de
espectro extendido (ESBLs del inglés extended expectrum ß-lacta-
mases) y carbapenemasas]. en concreto se escogieron cuatro ß- lac-
tamasas, que de acuerdo con la clasificación de Ambler son: una
ß-lactamasa de clase A capaz de hidrolizar el antibiótico ß-lacta-
mámico carbapenem, denominada “SME-1” proveniente de Serratia
marcescens s6 (37); una ESBL de clase A denominada “KLUG-1” ó
“imiA” proveniente de Kluyvera georgiana (38); una carbapene-
masa de clase A denominada “BKC-1” que procede de Klebsiella
pneumoniae (39); Y otra ESBL de clase A capaz de hidrolizar car-
bapenem denominada “KPC-1” proveniente de una cepa resistente,
Klebsiella pneumoniae 1534 (40).
2.2.2 Obtención de secuencias ancestrales
Para la selección de las secuencias ancestrales que han
sido sintetizadas en el proyecto se contó con la colaboración del Dr.
barry G. Hall (Bellingham Research Institute), experto a nivel mun-
dial en el estudio de la evolución experimental de ß-lactamasas.
estas secuencias se obtuvieron a partir de 2 alineamientos: uno
construido a partir de las secuencias peptídicas de 48 ß-lactamasas
actuales utilizadas previamente en el trabajo realizado por risso et
al. en 2014 en combinación con las secuencias de las 4 enzimas nom-
bradas en el apartado anterior, y otro alineamiento construido a
partir de 16 secuencias de ß-lactamasas de clase A e incluyendo las
4 proteínas actuales escogidas para el estudio, que pueden tener
capacidad de hidrolizar carbapenémicos. cabe destacar, que este
segundo alineamiento se realizó para obtener un modelo más con-
creto de la filogenia de las ß-lactamasas de clase A y su evolución
hacia la resistencia hacia antibióticos carbapenémicos. La herra-
mienta informática utilizada para alinear las secuencias fue el pro-
grama gratuito Guidance 2.
A partir de este alineamiento, se estimó la filogenia de estas
secuencias mediante el método de máxima verosimilitud ML utilizando
el programa informático gratuito meGA. Finalmente, la obtención de
las secuencias de ADn y proteínas más probables correspondientes a
cada uno de los nodos del árbol filogenético se obtuvieron mediante
la herramienta informática diseñada por el Dr. barry G. Hall deno-
minada extAnceseqProt.
tras obtener las secuencias ancestrales, el Dr. barry G. Hall
seleccionó aquellas situadas en los nodos que correspondían a los an-
cestros más comunes recientes (MRCA de sus siglas en inglés). en el
caso de la filogenia construida con las 48 secuencias provenientes del
trabajo de risso et al., se seleccionaron los MRCAs de las betaproteo-
bacteria, Alphaproteobacteria, Proteobacteria (gram negativas): nodos
Reconstrucción ancestral de una b-lactamasa y comparativa
159con sus homólogos actuales
Gonzalo Fernández Balaguer, Carmen Del Águila, Carolina Hurtado Marcos Y Rubén Agudo Torres
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº 2 (2021) · pp. 155 - 170
75, 92 y 90, respectivamente. en el caso de la filogenia obtenida uti-
lizando el conjunto de 16 ß-lactamasasde clase A, se seleccionó el
nodo perteneciente al MRCA más antiguo: nodo 26. (Anexo ML-phylo).
Finalmente, se seleccionó un MRCA de ß-lactamasas pertenecientes
a bacterias gram negativas denominado GncA (del inglés Gram ne-
gative Common Ancestor) que había sido caracterizado anteriormente
(21) para ser utilizado como control.
2.2.3 Síntesis de secuencias ancestrales y actuales
Las secuencias pertenecientes a los nodos 75, 90, 92 y 26
(denominadas Anc 75, Anc 90, Anc 92 y Anc 26, respectivamente), así
como la secuencia ancestral GncA y la secuencia del gen actual bKc-
1 se obtuvieron mediante síntesis química (eurofins Genomics) los
genes actuales KLuG-1 (imi A), KPc-1 y sme-1 se obtuvieron me-
diante amplificación por Pcr a partir de muestras obtenidas del ADn
bacteriano correspondiente. este material genético se extrajo mediante
el método fenol/cloroformo (35) a partir de las bacterias Kluyvera ge-
orgiana y Serratia marcescens s6, cedidas por el Dr. Patrice nordmann,
y Klebsiella pneumoniae, cedida por la Dra. Ana cristina Galesa.
2.3 Clonaje de las secuencias ancestrales y actuales en el
vector pACSE3
todos los genes codificantes de ß-lactamasas utilizados en
este trabajo se clonaron dentro del vector pAcse3 (Figura 2).
tanto los genes obtenidos por síntesis química, como el ADn
purificado de las bacterias Kluyvera georgiana, Klebsiella pneumoniae
y Serratia marcescens s6 se amplificaron por Pcr utilizando parejas
de iniciadores específicos (tabla A1). durante esta amplificación, se
introdujeron por mutagénesis dirigida las dianas de las enzimas de
restricción Sac I y Bsp HI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente, de
los genes de interés. Los amplicones obtenidos se purificaron con el
kit nucleospin™ Gel and Pcr clean-up y se digirieron utilizando las
enzimas de restricción Sac I y Bsp HI durante 1 h a 37 ºc para obtener
el ADn utilizado como inserto. todo el producto de digestión se cargó
en un gel de agarosa (1% p/v), y tras electroforesis se aisló del gel
mediante el kit. Por otro lado, el vector pAcse3 purificado mediante
el kit nucleospin™ Plasmid miniprep, se digirió utilizando las mismas
enzimas de restricción en presencia de cIP para eliminar los fosfatos
de los extremos 5’de las cadenas de ADn.
una vez realizada la digestión tanto el vector como los como
insertos se purificaron y se ligaron (utilizando una relación molar
entre el vector y el inserto de 1:7) con ligasa t4 durante 1 h a 25 ºc.
tras la ligación, se procedió a la purificación utilizando el kit corres-
pondiente.
Finalmente, 2 µL del producto purificado de la ligación se
transformaron en 50µL de bacterias E. Coli DH5e electrocompetentes
utilizando un electroporador Gene Pulser® II Electroporation System
siguiendo las indicaciones del fabricante. este proceso se realizó con