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resistencias, sin embargo, se ha demostrado que aunque se reduzca
el número de prescripciones de antibióticos, no se consigue reducir
la resistencia, sino que en algunos casos incluso se puede aumentar,
como fue el aumento de bacterias nosocomiales súper resistentes,
debido a su uso necesario en un lugares muy concretos y de manera
continuada (27). Por lo tanto, parece necesario comprender las ca-
racterísticas biológicas de las ß-lactamasas, desde el origen de su
promiscuidad hasta su alta capacidad para evolucionar ante el
estrés, para poder prever que tipo de mutaciones sufrirán los genes
de resistencia ante el uso continuo de un fármaco o ante los nuevos
fármacos que pudieran salir al mercado (28).
en este sentido, el grupo del profesor barry G. Hall ha
descrito un modelo de evolución dirigida de proteínas que mimetiza
la evolución natural en el laboratorio utilizando como objeto de es-
tudio el gen tem-1 que codifica para una ß-lactamasa que hidroliza
penicilinas y algunas cefalosporinas (29). una de las conclusiones
de este estudio resaltaba que a la hora de predecir futuras muta-
ciones de un linaje uno de los métodos más efectivos es mimetizar
la evolución natural mediante una evolución in vitro de proteínas
ancestrales reconstruidas.
La reconstrucción ancestral de proteínas (Ancestral Se-
quence Reconstruction, o Asr), es una técnica basada en la obten-
ción de proteínas del pasado utilizando una combinación de
herramientas filogenéticas y de biología molecular. su uso principal
es poder estudiar en el laboratorio la evolución natural de una fa-
milia de proteínas y deducir su futuro linaje a través del análisis y
detección de los cambios estructurales que ha tenido que sufrir un
gen para dar lugar a sus homólogos actuales (30). el estudio y ca-
racterización de estas proteínas ha permitido, por ejemplo, com-
prender características como la relación existente entre la secuencia
de aminoácidos de una proteína y su posible función, así como des-
cifrar posibles características proteicas (estabilidad a altas tempe-
raturas, promiscuidad, etc.) inferidas por el estrés medioambiental
de hace millones de años (31).
el proceso de obtención de una proteína ancestral consta
de una serie de pasos:
a) Hacer un alineamiento de múltiples ß-lactamasas actuales ho-
mólogas a partir de las cuales quiera inferirse su secuencia ancestral. ciclina (tet), glicerol y el isopropil-ß-D-1- tiogalactopiranósido
estas secuencias se obtienen de bases de datos como uniProt o ncbI;
b) estimar la filogenia de estas secuencias mediante algún método
de inferencia estadístico como la máxima parsimonia, la máxima
verosimilitud o la inferencia bayesiana (mP, mL e Ib, respectiva-
mente); c) generar la secuencia más probable para cada nodo del
árbol filogenético; d) Producir y expresar la proteína codificada por
la secuencia ancestral seleccionada (31). todos los pasos desde el
“a)” hasta el “c)” precisan el uso de distintas herramientas compu-
tacionales. Actualmente, existen diversos programas gratuitos con
Ancestral reconstruction of a b-lactamase and comparison with
158 its extant proteins
Gonzalo Fernández Balaguer, Carmen Del Águila, Carolina Hurtado Marcos y Rubén Agudo Torres
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº 2 (2021) · pp. 155 - 170
ANALES
RANF
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los que poder realizar todo el proceso de reconstrucción ancestral
de proteínas de manera eficaz (32).
esta técnica científica ya se ha utilizado para el estudio y
la mejora de proteínas actuales. se pueden encontrar diversos ejem-
plos como puede ser la utilización de la reconstrucción ancestral de
la proteína ancestral de factor VIII de coagulación, para producir
una proteína con más estabilidad, menos inmunogénica y con una
mejora de la actividad funcional (33); o la obtención, mediante Asr
de mutantes de la enzima rubIscO mucho más eficientes a la hora
de fijar el cO2 (34).
con el fin de profundizar en el conocimiento de la acción
y el origen de actividad hidrolítica de las ß-lactamasas de clase A
(atendiendo a la nomenclatura de Ambler) en este trabajo hemos
caracterizado el perfil de resistencia de 4 ß-lactamasas de espectro
extendido y de un ancestro común reconstruido por Asr frente a 8
antibióticos ß-lactámicos de uso clínico.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Reactivos
A partir de bacterias E. coli JM109 (end A1 gln V44 thi-1 rel A1 gyr
A96 rec A1mcrb+?(lac - pro Ab)e14- [F'tra D36 pro Ab+ lacI q lac
Z?m15] hsd r17(rK-mK+), cedidas por la Dra. maría Isabel martí-
nez Jiménez (cbmsO); y E. coli DH5e (F-f80dlac Z?m15 ?(lac
ZYA-arg F) u169 end A1 rec A1 hsd r17(r- m+) deo r thi-1 pho A
sup e44 ?– gyr A96 rel A1 gal-; thermoFisher scientific) se obtu-
vieron células electrocompetentes utilizando un protocolo estanda-
rizado (35). el vector pAcse3 fue cedido por el Dr. barry Hall (36).
Los compuestos Aztreonam (Atm), cefotaxima (ctX), cefepima
(FeP), cefuroxima (cXm), ceftazidima (cAZ), ceftriaxona (crO) e
Imipenem (ImP) se obtuvieron de la empresa medchemexpress.
el medio de cultivo en polvo Lb, ampicilina (AmP), tetra-
(IPtG) se consiguieron a través de la empresa Applichem. La solu-
ción stock de cada uno de los antibióticos se realizó utilizando 0.1m
de tampón naPO4 a pH 7.0 y se almacenó a -80ºc en estas concen-
traciones: AmP, ctX y cXm a 128 g/L; tet a 15 g/L; FeP e ImP a 8
g/L; Atm, cAZ y crO a 4 g/L. Las enzimas de restricción Sac I y Bsp
HI, la DnA polimerasa Phusion® High-Fidelity (HF), la ligasa t4
y la enzima fosfatasa alcalina (cIP proveniente del inglés “Calf in-
testine phosphate”) se adquirieron de la empresa new england bio-
labs. el SYBR® Green II fluorescent dye, el medio de cultivo en
polvo müler-Hinton y los oligonucleótidos utilizados se compraron
a la casa comercial µ-Aldrich. Los kits de purificación de ADn (Nu-
cleoSpin™ Gel and PCR Clean-up Kit ) y de aislamiento de plásmido
se consiguieron a través de la empresa macherey-nagel.