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ANALES
RANF
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pendientes de IFN-b en macrófagos aislados de ratones deficientes
en receptores TLRs o en las moléculas adaptadoras MyD88 y TRIF re-
velaron un papel fundamental del complejo heterodimérico TLR2-TLR6
y de la proteína adaptadora MyD88 en la detección tanto de MVA como
de NYVAC. Del mismo modo, solo MDA5 e IPS-1 estuvieron involucra-
dos en la detección intracelular de ambas cepas y en la producción de
IFN-b y de las quimioquinas dependientes de IFN-b en
macrófagos. Tanto en MVA como en NYVAC la interacción entre TLR2-
MyD88 y el inflamasoma NALP3 fue esencial para la expresión y el
procesamiento de la pro-IL-1b en IL-1b madura.
La detección de MVA por los diferentes receptores de reco-
nocimiento de patrones descritos (TLR2-TLR-6-MyD88, MDA5-IPS-1 y
el inflamasoma NALP3) activó de forma eficiente múltiples vías de se-
ñalización intracelular, incluyendo NFkB, ERK-1/2, JNK, IRF3, IRF7 y
STAT-1, mientras que la detección de NYVAC indujo una activación muy
débil de dichas rutas (Figura 6).
Este trabajo, publicado en la revista “PLoS Pathogens” (15),
además de definir los componentes moleculares involucrados en el re-
conocimiento de las cepas atenuadas MVA y NYVAC, demostró por pri-
mera vez la implicación directa de MDA-5 en la detección innata de
un virus ADN y la interacción entre las vías TLR y NLR en el contexto
de una infección viral.
2.4. Distribución in vivo
Los poxvirus, y en particular el VACV, pueden diseminarse
dentro del hospedador mediante: (i) propagación directa de célula a
célula utilizando colas de actina; (ii) como virus libre; (iii) leucocitos caron que la eficiencia de expresión génica de MVA es mayor que la
infectados; y/o (iv) motilidad celular inducida por virus. Se cree que
los EVs son particularmente importantes para una rápida diseminación
célula a célula in vivo, mientras que los MVs probablemente contribu-
yan a la propagación a distancia del virus tras la muerte celular o rup-
tura de la membrana (16).
En contraste con las cepas del VACV competentes en replica-
ción, los virus atenuados MVA y NYVAC no producen progenie viral en
la mayoría de las células de mamíferos; sin embargo, como definimos
anteriormente, poseen un comportamiento diferencial in vitro que
afecta tanto a procesos de replicación y morfogénesis viral como al per-
fil inflamatorio que desencadenan en la célula hospedadora.
Con estos antecedentes, era importante caracterizar la dise-
minación in vivo de ambos virus y analizar la cinética de expresión de
genes heterólogos codificados por recombinantes basados en ellos en
diferentes tejidos. Para abordar este objetivo generamos vectores re-
combinantes basados en MVA o NYVAC que expresan como marcador
reportero la proteína luciferasa. Los virus recombinantes obtenidos
fueron inoculados en ratones BALB/c empleando diferentes rutas sis-
témicas o de mucosas y su capacidad de diseminación fue evaluada
mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI, “Bioluminescence Ima-
ging”). Esta técnica ofrece la posibilidad de estudiar procesos biológicos
MVA-B como candidato vacunal frente al VIH/SIDA: de la inves-
tigación básica a los ensayos clínicos profiláctico y terapéutico.
Carmen Elena Gómez Rodríguez
An Real Acad Farm Vol. 86. Nº 1 (2020) · pp. 29 -60
en organismos vivos y se basa en la detección de luz visible emitida
tras la descarboxilación oxidativa de la luciferina, una reacción que es
catalizada por la enzima luciferasa en presencia de ATP y oxígeno (17).
Además de monitorizar la expresión de un determinado gen, esta tec-
nología nos permite cuantificar en un mismo animal la progresión de
la infección viral en el espacio y en el tiempo, identificando las varia-
ciones en replicación y diseminación del virus. De hecho, dada la gran
utilidad que ha tenido en el campo de la poxvirología, hemos escrito
un capítulo dedicado a ella en el libro “Vaccinia Virus. Methods and
Protocols” por invitación de su editor, el Dr. Jason Mercer (18).
Este estudio, publicado en la revista “Journal of General Vi-
rology”, con mi contribución como primera autora (19), demostró que
existen diferencias en el comportamiento in vivo entre las cepas MVA
y NYVAC que afectan tanto a los niveles de expresión del gen heteró-
logo como a su permanencia dentro del animal. En la mayoría de las
rutas analizadas la expresión del gen reportero es transitoria, limi-
tándose a las 24 horas post-inoculación en el caso de los animales in-
munizados con el recombinante basado en MVA y permaneciendo hasta
las 72 horas post-inoculación en el recombinante basado en NYVAC.
En ninguno de los órganos analizados (cavidad peritoneal, bazo, nó-
dulos linfáticos y ovarios) se detectaron partículas infecciosas, confir-
mando la capacidad de replicación restringida de ambos vectores y
avalando su perfil de seguridad. Las rutas de administración sistémicas,
en particular la ruta intraperitoneal (i.p.) y la intramuscular (i.m.), re-
sultaron más efectivas que las rutas de mucosas. Ambos virus tienen
la capacidad de alcanzar e infectar tejidos diana distintos a los del sitio
de inoculación; sin embargo, los resultados obtenidos al evaluar la ci-
nética de expresión de luciferasa mediante ensayos bioquímicos indi-
de NYVAC a tiempos tempranos post-infección, lo que podría estar re-
lacionado con la susceptibilidad de determinados tipos celulares a la
infección por ambas cepas (Figura 7).
Para extender estos resultados a otro modelo animal reali-
zamos un estudio, como parte de un equipo multidisciplinario liderado
por el Dr. Max Corbett, que evaluó la distribución, seguridad e inmu-
nogenicidad de virus recombinantes basados en MVA y NYVAC cuando
se administran mediante aerosoles a primates no humanos. Esta ruta
de inoculación ofrece ventajas potenciales de seguridad, logística y
ahorro de costes sobre las rutas tradicionales de vacunación y repre-
senta una alternativa en el contexto de patógenos transmitidos por
ruta de mucosas.
Los resultados obtenidos demostraron la viabilidad y el po-
tencial del uso del aerosol para administrar las cepas atenuadas MVA
y NYVAC. Las imágenes de gammagrafía in vivo realizadas a tiempo
real en las regiones de la cabeza y el tórax de los animales que inha-
laron los vectores radiomarcados revelaron que tanto MVA como NYVAC
se depositan de forma eficiente en varias regiones de la mucosa, in-
cluyendo los pulmones, los senos paranasales, la boca, la región oro-
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