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The nucleotide vesicular transporter (VNUT). Relevance in neural and neuroendocrine tissues. New pharmacological perspectives
vesicular de ATP requiere el consumo de ATP por la V-
ATPasa para generar el gradiente electroquímico de
protones que impulse el transporte activo, pero si esto
ocurre, el ATP, como sustrato para el transporte,
disminuye, dificultando así la medida cuantitativa de dicho
transporte. Rudnick se refirió a este dilema como “el
demonio del transporte de ATP” (74). Sin embargo, a
pesar de esta dificultad añadida, ha sido posible describir
adecuadamente las características de este sistema de
transporte.
2.1. Transporte de nucleótidos a gránulos cromafines
Las primeras evidencias del transporte de nucleótidos a
gránulos cromafines fueron obtenidas en la década de
1970. Varios trabajos mostraron que es posible marcar el
ATP presente en el interior de los gránulos perfundiendo las
glándulas adrenales con [3H]-adenosina o [32P]-fosfato (75-
77). Más adelante, se demostró que dicho ATP no era
generado en el interior de los gránulos, sino que era
sintetizado en el exterior y posteriormente transportado al
interior de estos orgánulos (78).
Para tratar de caracterizar el transporte de ATP, se
llevaron a cabo una serie de experimentos en gránulos
aislados. La existencia de un proceso de transporte
dependiente de temperatura y bloqueado por atractilósido,
un compuesto previamente descrito como inhibidor del
intercambiador ADP/ATP de la mitocondria, llevó a pensar
que se trataba de un mecanismo mediado por transportador
en lugar de un mero proceso de difusión pasiva (79). El
hecho de que el transporte de nucleótidos sea activado por
Mg2+ e inhibido por EDTA (80), hizo pensar que el
transporte de nucleótidos estaba ligado a la ATPasa
dependiente de Mg2+ presente en la membrana de los
gránulos, la cual actúa como una bomba de protones,
originando un gradiente electroquímico necesario para el
transporte. Empleando iones NH4+, los cuales eliminan el
gradiente de pH, o nigericina, que en presencia de K+
extragranular también suprime el gradiente de pH mediante
el intercambio de K+ por H+, el transporte de nucleótidos
continuaba activado (80). Por otro lado, empleando iones
permeables, como tiocianato, los cuales neutralizan la
diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana, el
transporte de nucleótidos quedaba fuertemente inhibido
(81). Todo ello indicaba que este transporte depende de la
parte eléctrica del gradiente (??).
El análisis cinético del transporte de ATP a los gránulos cromafines mediante la técnica de citometría de flujo (87).
arroja un valor de Km para el ATP en torno a 1 mM, en
ausencia de Mg2+ (80, 81). Sin embargo, la Km para el ATP
en presencia de Mg2+ parece ser de 2,9 mM (81). El
transportador no es específico, sino que es capaz de
transportar otros nucleótidos de adenina como ADP y
AMP, así como GTP y UTP (80, 81) (Figura 4). Cuando
los gránulos fueron incubados con ADP marcado, aparecía
dentro del gránulo, no sólo este compuesto, sino además
cantidades significativas de ATP marcado (80). Este ATP
no era generado en el medio de incubación y
posteriormente captado por los gránulos, sino que el ADP
era transformado en ATP tras su transporte al interior de
los orgánulos, probablemente mediante una reacción de
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transfosforilación con los nucleótidos ya presentes en el
interior de las vesículas. Más adelante se demostró que las
proteínas solubles de los gránulos cromafines contienen
una enzima capar de transferir el grupo fosfato terminal
del ATP al ADP (82, 83).
Una nueva aproximación metodológica al estudio del
transporte de nucleótidos a los gránulos cromafines, se
llevó a cabo mediante el uso de derivados fluorescentes de
los nucleótidos de adenina como sustratos del transporte y
el análisis y medida de los nucleótidos internalizados, por
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), tras la
lisis de los orgánulos. Estos análogos fluorescentes de los
nucleótidos contienen un puente eteno adicional en el
anillo de purina y son conocidos como eteno-nucleótidos
(e-nucleótidos). Estos estudios permitieron establecer la
incorporación de los derivados fluorescentes del ATP,
ADP y AMP (e-ATP, e-ADP y e-AMP) al interior de los
gránulos cromafines (8), lo que es una prueba adicional de
la falta de especificidad del transportador (Figura 4). Esta
metodología también proporciona una aproximación útil al
estudio del metabolismo de los nucleótidos tras su
internalización en los gránulos. Estos estudios
corroboraron la existencia de actividades enzimáticas que
intercambian los grupos fosfato entre los nucleótidos
internalizados, indicando que el contenido intragranular de
nucleótidos puede no reflejar la distribución de estos
compuestos en el citosol. En este sentido, se midieron
elevados niveles de e-ATP en el interior de los gránulos
tras el transporte de e-ADP (8). Además, se describió la
presencia de e-adenosina tetrafosfato (e-Ap4) en el interior
de los orgánulos tras el transporte de e-ATP (84). El
adenosina tetrafosfato (Ap4) es un constituyente natural de
los gránulos cromafines (84, 85) que actúa como un
potente agonista de determinados receptores purinérgicos
(86). Una posible explicación a su presencia en el interior
de los orgánulos, además de su trasporte desde el exterior
de las vesículas, dada la baja especifidad del transportador,
podría ser su síntesis intragranular, mediante el
intercambio de fosfato entre los nucleótidos granulares, de
acuerdo a los resultados obtenidos tras el transporte de e-
ATP (84). El uso de estos derivados fluorescentes como
sustrato del transporte, ha permitido también el estudio del
almacenamiento de los nucleótidos en los gránulos
Estos ensayos mostraron además un inesperado incremento
en el tamaño de los gránulos, dependiente de la
concentración de e-ATP, que tenía lugar en paralelo con el
incremento de fluorescencia debido a la acumulación de
este nucleótido en las vesículas (87).
A pesar de la creciente relevancia fisiológica de los
diadenosina polifosfato como señales extracelulares, no
existían datos bibliográficos acerca de su mecanismo de
almacenamiento en las vesículas secretoras. En 1997,
mediante una combinación de técnicas radiométricas y
ensayos fluorimétricos, basados en el uso de eteno-
derivados, se describió por primera vez el transporte de los
diadenosina polifosfato a gránulos secretores, los gránulos
cromafines (88). El transporte de diadenosina pentafosfato
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