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Solid lipid nanoparticles for gene therapy

homogéneamente por todo el citoplasma, pero en las presencia del péptido en las SLNs incrementó la capacidad
células de retina estaban localizados en la zona de transfección de los vectores, incremento que se
correspondiente al retículo endoplasmático rugoso y al relacionó con el proceso de internalización, que en ambas
aparato de Golgi, donde son sintetizados los lisosomas. líneas celulares se produce por endocitosis mediada por
Esto demuestra que la menor transfección que se observó clatrinas y por endocitosis mediada por caveolas. Aunque
en las células ARPE-19 estaba asociada a la endocitosis en ambos casos el SAP aumentó la transfección actuando
mediada por clatrinas, que conduce a los vectores hacia los sobre la endocitosis, el mecanismo fue diferente
lisosomas, donde el material genético se puede degradar. dependiendo de la línea celular. En las células HEK293, el
Otra razón que puede justificar la menor transfección de incremento de la transfección se relacionó con una mayor
los vectores en ARPE-19 está relacionada con la entrada entrada de los vectores en las células. Sin embargo, en las
del ADN en el núcleo. Las células HEK293 se dividen más células ARPE-19, el SAP no modificó el grado de
rápidamente que las células ARPE-19, por lo que la internalización celular. En estas células observamos que
entrada en el núcleo será más difícil en estas últimas. Una incrementaba la internalización de las SLN por endocitosis
vez caracterizados los vectores y estudiado su mediada por caveolas y este cambio en el mecanismo de
comportamiento intracelular, se estudió su capacidad de entrada, de clatrinas a caveolas, daría lugar a una
transfección in vivo (34) tras su administración por vía reducción de la degradación lisosomal, favoreciendo la
endovenosa a ratones Balb/c. Tras el análisis de muestras localización de los vectores en las inmediaciones del
de pulmón, hígado y bazo, pudimos observar expresión de núcleo, lo que facilita su entrada en el mismo, y por tanto
proteína en estos dos últimos órganos hasta 7 días después la transfección.
de la administración, pero no a nivel pulmonar.
5.2. Utilización de péptidos con señales de internalización
5. ESTRATEGIAS PARA INCREMENTAR LA nuclear: protamina
CAPACIDAD DE TRANSFECCIÓN
Otra estrategia para incrementar la capacidad de
5.1. Utilización de péptidos de penetración celular: SAP transfección de nuestros vectores fue la incorporación en
las SLNs de protamina, un péptido de señalización nuclear,
El uso de péptidos capaces de atravesar las membranas que además actúa facilitando la transcripción y presenta
celulares (péptidos de penetración celular o CPP) es una una gran capacidad de condensación de los ácidos
estrategia muy utilizada en terapia génica para incrementar nucleicos, lo que favorece su protección frente a la
la capacidad de transfección de los vectores no virales. degradación (48). Preparamos los vectores con SLNs y
Muchos de estos péptidos contienen aminoácidos cargados diferentes proporciones de protamina (40) y comprobamos
positivamente, y son hidrofóbicos, normalmente debido a como la capacidad para incrementar la transfección
una secuencia anfipática (45). Para incrementar la dependía de la línea celular. En las células HEK293,
capacidad de transfección, incorporamos en las SLNs el contrariamente a lo esperado inicialmente, la capacidad de
péptido SAP (46), cuya secuencia es (VRLPPP)3 transfección disminuía a medida que aumentaba la
(compuestos por tres unidades repetidas de VRLPPP; V: proporción de protamina en las nanopartículas. En cambio,
valina; R: arginina, L: leucina, P: prolina), que presenta en las células ARPE-19, la protamina incrementaba la
ciertas ventajas sobre otros CPP debido a su origen no transfección cuando se utilizaba en una proporción
viral, anfipaticidad, solubilidad en agua, y a su falta de determinada, por encima de la cual, la transfección
toxicidad (47). La presencia de SAP en los vectores no disminuía. En la figura 5 se recoge una gráfica con los
modificó la carga superficial pero sí el tamaño de partícula niveles de transfección de las formulaciones de SLNs con
cuando la cantidad de SAP en el complejo era más diferente proporción de protamina en las células HEK293
elevada. Tanto en células HEK293 como en ARPE-19, la y ARPE-19.

100 HEK293 100 ARPE-19

80 80
%?células?transfectadas
%?células?transfectadas
60 60

40 40

20 20

0 0,5:1:5 1:1:5 2:1:5 3:1:5 0 0,5:1:5 1:1:5 2:1:5 3:1:5 5:1:5
SLNs SLNs

Protamina:ADN:SLNs Protamina:ADN:SLNs

Figura 5. Porcentaje de transfección de células HEK293 y ARPE-19 tratadas con los vectores preparados con SLNs y diferentes
proporciones de protamina.

Los estudios de internalización celular mostraron la por caveolas, independientemente de la presencia o no de
falta de correlación entre la entrada en la célula del vector protamina. Sin embargo, en las células de retina la
y el nivel de transfección. En células HEK293, los protamina indujo un cambio en el mecanismo de
vectores entran mayoritariamente por endocitosis mediada internalización, pasando de endocitosis mediada por

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