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Alicia Rodríguez Gascón, M.ª Ángeles Solinís Aspiazu, Ana del Pozo Rodríguez
Solución?acuosa?de Evaporación?
DOTAP?+?Tween 80 del?solvente
Precirol®ATO5? Suspensión?SLNs
en?un?solvente?
Emulsión
orgánico
SLNs ácido?nucleico?(ADN,?ARN) Vector?final
Figura 4. Esquema con el método de elaboración de nuestros vectores a base de SLNs.
El DOTAP es uno de los lípidos catiónicos más nanopartículas, la capacidad de protección disminuía. Por
utilizados en terapia génica. Su actividad tensioactiva el contrario, para las proporciones más bajas de ADN en
permite formar la emulsión inicial, y su carga positiva las SLNs, el alto grado de condensación impedía su
facilita la interacción con las cargas negativas del ADN. liberación. Los estudios de transfección en HEK293
Por otro lado, el Tween 80 es uno de los tensioactivos más pusieron de manifiesto que la mayor eficacia de
utilizados en la industria farmacéutica; además las cadenas transfección se conseguía con la formulación que era capaz
de poli(etilenglicol) (PEG) del Tween 80 reducen la de condensar completamente el plásmido, lo protegía de la
agregación de las nanopartículas, reduciendo su toxicidad acción de la DNasa I, y no impedía su liberación, y nos
y aumentando el tiempo de circulación en el organismo. permitió seleccionar la relación DOTAP:ADN de 5:1 para
En nuestro estudio, se evaluaron diferentes proporciones estudios posteriores. Estos resultados pusieron de
de DOTAP y Tween 80, siendo la proporción DOTAP manifiesto la importancia, a la hora de diseñar un vector,
0,4% y Tween 80 0,1% la que proporcionó eficacias de de conseguir un equilibrio entre estos tres procesos: unión,
transfección mayores. Otro factor a tener en cuenta a la protección y liberación. Otra característica que deben tener
hora de diseñar los vectores es la carga de ADN en las los vectores para poder ser útiles en terapia génica, es la
nanopartículas (expresada como relación entre el DOTAP seguridad. Nuestros vectores demostraron que, una vez
y el ADN, en peso), ya que condiciona el tamaño de administrados en los cultivos celulares, no producían una
partícula, el potencial zeta o carga superficial, la capacidad disminución de la viabilidad celular.
de protección frente a desoxirribonucleasas, y la capacidad
para que el ADN se libere a nivel intracelular. Utilizando Comprobamos la eficacia de transfección a lo largo del
el plásmido que codifica para la proteína verde tiempo en dos modelos celulares: HEK293 y ARPE-19
fluorescente (pCMS-EGFP), evaluamos distintas (células humanas de epitelio pigmentado de retina). Las
proporciones DOTAP:ADN (entre 15:1 y 1:1) y SLNs fueron capaces de transfectar ambas líneas celulares,
caracterizamos los vectores en términos de tamaño de aunque los niveles de transfección en las células ARPE-19
partícula, carga superficial, capacidad de unión del fueron menores que en las HEK293. Además, en las
plásmido, capacidad de protección frente a DNasa I, células HEK293, la expresión de proteína se detectó a
capacidad de liberación, y eficacia de transfección en partir de las 24 horas, mientras que en las células de retina
células HEK293 (células embrionarias de riñón humano). no se detectó hasta las 72 horas. Esta diferencia en la
El tamaño, en el rango nanométrico, y la carga superficial producción de la proteína puede ser debida a las diferentes
o potencial zeta de los vectores son fundamentales para la barreras que tiene que superar el ADN contenido en la
transfección. Los vectores presentaron un tamaño de nanopartícula hasta llegar al núcleo de la célula y que
partícula que osciló entre 217 nm y 260 nm para los dependen de la formulación. Por ello, utilizando SLNs
vectores preparados con DOTAP:ADN entre 15:1 y 4:1, y marcadas con el fluoróforo rojo NileRed, estudiamos la
en el caso de los vectores preparados con DOTAP:ADN de internalización celular en los mismos modelos celulares
3:1, su tamaño fue mayor de 1 µm, indicativo de la (38). Pudimos observar una internalización más lenta en
formación de agregados. En cuanto a la carga superficial, las células ARPE-19 que en las células HEK293, lo que
osciló entre +32 y +47 para los vectores con tamaño puede justificar el retraso en la transfección observado.
nanométrico; sin embargo, la carga superficial de los Comprobamos además, que en las células HEK293, los
vectores con tamaño mayor de 1 µm fue negativa, debido vectores eran captados principalmente por endocitosis
al alto contenido de ADN. La capacidad de protección del mediada por caveolas, mientras que en las células ARPE-
ADN se mantuvo cuando las SLNs se prepararon con 19 entraban mayoritariamente por endocitosis mediada por
proporciones DOTAP:ADN de 4:1 o superiores, y a clatrinas. También encontramos diferencias en la
medida que aumentaba la proporción de ADN en las disposición de los vectores a nivel intracelular: en las
células HEK293 se encontraban distribuidos
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