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Role of insulin receptor A isoform and IGF-1R in the development of atherosclerotic plaque
después incubadas con los correspondientes estímulos. En
los experimentos de señalización de insulina, captación de
glucosa y del mRNA, las células estaban en
subconfluencia (70-80%).
2.3. Western Blot
Los estudios de Western blot se realizaron con los
extractos totales de las VSMCs o de las arterias aortas
como previamente se ha descrito (9). Los anticuerpos
utilizados fueron anti-IRß (Ab-4) de Oncogene, phospho-
AKT (Ser473), AKT, p-p706K (Ser389), p70, pERK-1/-2
(S202/T204) y ERK de Cell Signalling, Glut-4, TNF-R1 y
TNF-R2, de Santa Cruz Biotechnology, p53 de Millipore,
a- y ß-actina y a-tubulina anticuerpos de Sigma-Aldrich
Corp. El anticuerpo frente a la isoforma B del IR (+exón
11) fue cedido generosamente por el Dr. Sesti y la Dr.
Hribal.
2.4. Inmunoprecipitación
Para obtener el total de las células lisadas, se rasparon
con PBS frío y se centrifugaron a 4000 x g, durante 10 min
a 4°C, y a continuación el pellet se resuspendió en el
buffer de lisis. Posteriormente, se centrifugaron a 12,000 x
g for 10 min y se recogieron los sobrenadante. Para la
inmunoprecipitación, 150-200 µg de proteína se incubaron
con el anticuerpo primario a 4ºC toda la noche. Los
inmunocomplejos se incubaron con la proteína A o G
agarosa durante 4h, y finalmente, se sometieron a una
electroforesis en geles PAGE-SDS.
Para la inmunoprecipitación con extractos de proteínas
de arterias aortas, en el modelo ApoE-/- fue necesario
reunir muestras aórticas de 5 ratones ApoE-/- y juntamos
también otras 5 muestras de sus respectivos controles. Sin
embargo, se pudieron utilizar muestras individuales de tres
ratones por grupo en BATIRKO y controles de 52
semanas. 150 µg de proteínas se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo anti-IRB. Los sobrenadantes se
reinmunoprecipitaron nuevamente con el anticuerpo anti-
IRB. Los sobrenadantes de esta segunda
inmunoprecipitación se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo anti-IRß (que reconoce a las dos isoformas del
IR). Así, los inmunocomplejos (sólo habría de IRA) se
recogieron con la proteína A-agarosa y se sometieron a
una electroforesis en geles PAGE-SDS. Finalmente, las
membranas se incubaron con IGF-1R o con TNFR-1 para
estudiar la posible asociación entre la IRA e IGF-1R o
TNF-R1, respectivamente.
2.5. Aislamiento de membranas plasmáticas
Las VSMCs se resuspendieron en el buffer de
homogeneizado (20 mM Tris:HCl pH 7.4, 2 mM EGTA, 2
mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM ß-Mercaptoetanol,
10µg/mL Aprotinina, 10µg/mL Leupeptina) y se incubaron
durante 10 minutos a 4ºC. Las suspensiones se
homogeneizaron con un homogeneizador Douncer. A
continuación, se centrifugaron a 1300 rpm durante 10 min,
y el sobrenadante se salvó como fracción nuclear. Así, el
pellet se homogeneizó en el buffer + 1% triton-X-100 y se
incubó durante 1 h a 4ºC. Posteriormente, se centrifugaron
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a 14000 rpm durante 1 h y el sobrenadante se recogió
como fracción citosólica. Se detectaron los niveles de
Glut-4 por Western blot utilizando un anticuerpo anti-
Glut-4 (Millipore) en las fracciones citosólicas y de
membranas plasmática. Y se utilizaron como controles de
carga del Western blot, la incubación Anti-Na+/K+ ATPase
(Santa Cruz Biotechnology) y anti-GSK3ß (Cell
Signalling) en las fracciones de membrana y citosólica,
respectivamente.
2.6. Captación de glucosa
Las células con una confluencia del 80% fueron
mantenidas en ausencia de suero durante 4-6h. Después, se
estimularon con 10 o 100 nmol/L de insulina durante 30
minutos. La captación de glucosa se medía por incubación
de las células con 2-desoxy-d-[1-3H]-glucosa durante los
últimos 10 minutos por triplicado en seis experimentos
independientes como previamente se ha descrito (9).
2.7. PCR y qRT-PCR
El RNA fue extraído de las arteria aortas y de las
VSMCs por el método del TRizol (Invitrogen, Barcelona,
España) y cuantificado su concentración por la medida de
absorbancia a 260 nm. 20 ng de RNA fueron necesarios
para la reacción de la transcriptasa inversa, durante 15 min
a 25ºC y 2h a 37°C, con el kit High Capacity cDNA
(Applied Biosystems, Foster City, CA). Se evaluaron la
expresión de distintos genes implicados en el proceso
aterosclerótico en la arteria aorta así como la expresión de
IRA, IRB, IGF-1R y TNFR-1 en la aorta y las VSMCs.
Como control interno se utilizó la GADPH. La reacción en
cadena de la polimerasa se realizó en un termociclador
7500 Real-Time PCR, y la cuantificación relativa con el
software Prism 7000 system SDS software (Applied
Biosystems). La expresión de los genes analizados por
qRT-PCR se realizó según se ha descrito previamente (9).
Así, RQ correspondería con 2-??Ct [?Ct = Ct (gen díana) –
Ct (gen endógeno); ??Ct = ?Ct para una muestra - ?Ct
para el control].
En la caracterización de las líneas celulares generadas
para confirmar la reconstitución de las líneas IRA e IRB
VSMCs, se realizó un RT-PCR a partir de 5 µg del RNA
total utilizando unos oligonucleótidos que reconocen el
exón 11 del IR murino para IRLoxP+/+ e IR-/- (primer 1:
5´-ATCAGAGTGAGTATGACGACTCGG-3´ y primer 2,
5´-TCCTGACTTGTGGGCA CAATGGTA-3) o del exón
11 del IR humano para IRA e IRB VSMCs (primer 1, 5´-
ACCAGAGTGAGTATGAGGATTCGG-3´ y primer 2,
5´-TCCGGACTCGTGGGCA CGCTGGTC-3´. Los
productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al
2%.
2.8. Estudios de proliferación por incorporación de BrdU
104 células en 1mL de medio completo fueron
sembradas en cada pocillo en las placas de 96 pocillos. Al
día siguiente, las células se mantuvieron en ausencia de
suero durante 5 horas y se estimularon con insulina, IGF-1,
IGF-2, TNF-a u otros estímulos aterogénicos durante 24
horas. Después, el ratio de proliferación celular se evaluó
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