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Almudena Gómez-Hernández et al.
estructural a la proinsulina e insulina, son constituyentes
habituales del plasma sanguíneo, donde circulan unidos a
IGFBPs. Regulan procesos de proliferación y
diferenciación en múltiples tipos celulares y son capaces
de ejercer los efectos metabólicos característicos de la
insulina, pero, a diferencia de ésta, son sintetizados por la
mayoría de tejidos del organismo (14). Los efectos
biológicos de los IGFs están mediados por receptores de
membrana específicos. El receptor de IGF-1 (IGF-1R),
homólogo al IR, es responsable de la señalización
intracelular de IGF-1 e IGF-2 (15). IGF-2 se une también
al IGF-2R, idéntico al receptor de manosa-6-fosfato que no
presenta actividad señalizadora para el crecimiento celular,
mientras que induce un efecto mitogénico a través de una
interacción de alta afinidad con IRA (16). En células que
co-expresan IR e IGF-1R, como es el caso de las VSMCs,
es posible la formación de receptores híbridos IR/IGF-1R
(17).
Por otro lado, el papel potencial de ambas isoformas
del IR en la aterosclerosis temprana es completamente
desconocido. Para poder estudiar el papel de las dos
isoformas del IR (IRA e IRB) en la proliferación y
migración de las células de músculo liso vascular
implicadas en las fases iniciales del proceso aterogénico,
se han generado nuevas líneas celulares. Las primeras
presentan el IR (WT VSMCs e IRLoxP+/+ VSMCs), otra
línea celular que carece del IR (IR-/- VSMCs), y otras dos
líneas celulares expresan la IRA (IRA VSMCs) o la IRB
específicamente (IRB VSMCs). En estas líneas celulares,
se han estudiado los ratios de proliferación y migración
inducidos por la insulina, IGFs o citoquinas
proinflamatorias (TNF-a) así como la asociación entre las
isoformas del IR y receptores aterogénicos o con el
receptor de IGF-1 (IGF-1R). Además, se ha estudiado la
expresión de ambas isoformas del IR, IGF-1R y TNFR-1
(receptor de alta afinidad de TNF-a) en dos modelos de
daño vascular, como un modelo clásico de aterosclerosis
(ApoE-/- sometido a dieta rica en grasa durante 18
semanas) y un segundo modelo de resistencia a la insulina
vascular y disfunción vascular (BATIRKO de un año de
edad) (18). Nuestros resultados parecen sugerir que la
IRA, y no la IRB, confiere una ventaja proliferativa y
migratoria a las VSMCs en respuesta a diversos estímulos
proaterogénicos. Además, la IRA podría asociarse con
IGF-1R favoreciendo las acciones aterogénicas de IGF-2
bajo condiciones inflamatorias.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Modelos experimentales
Los ratones macho fueron mantenidos en el animalario
según los estándares de temperatura y los ciclos de luz
recomendados. A los ratones ApoE-/- y sus controles wild-
type se les administró una dieta rica en grasas (Western
A04 + 21% kcal aportadas por los lípidos) durante 18
semanas desde la semana sexta. Los ratones se genotiparon
por PCR a partir de 10-200ng del DNA extraído de la cola.
Se sometió a una amplificación de 35 ciclos (30 segundos,
94ºC; 40 segundos, 68ºC; y 1 minuto, 72ºC) en el
130 @Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
termociclador. Los tres primers utilizados fueron los
siguientes: el oligonucleótido sentido, oIMR0180 (5´-
GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3´) y los dos
oligonucleótidos antisentidos, oIMR0181 (5´-
TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3´) y oIMR0182 (5´-
GCCGCCCCGACTGCATCT-3´). Una banda de 155 pb
se obtenía para el ratón WT y otra banda de 245 pb para el
ratón ApoE-/-. El ratón BATIRKO y sus controles de 52
semanas recibían dieta estándar (A04, 3% de las calorías
está aportada por la grasa). Además un grupo de animales
BATIRKO se trataron con un anticuerpo monoclonal anti-
TNF-a (MP6-XT22, Biolegend) (50
µg/intraperiotonealmente por animal) cada 3 días, durante
6 semanas. El genotipaje de los controles y de los animales
BATIRKO se realizó como se ha descrito previamente
(18).
Los ratones anestesiados con Avertin (250 mg/kg, ip)
se perfundieron con suero salino desde el ventrículo
izquierdo. Los arcos aórticos se incluyeron en OCT para
inmunohistoquímica y la aorta torácica se congeló para
valorar la expresión del mRNA de genes implicados en el
proceso aterosclerótico por PCR cuantitativa en tiempo
real (qRT-PCR). El estudio se ha realizado según los
acuerdos con la normativa de la Unión Europea y ha sido
previamente aprobado por el comité ético de nuestra
institución.
2.2. Cultivos celulares
En primer lugar, se aislaron las arterias aórticas
torácicas de 2 ratones macho IRLoxP/LoxP de 8 semanas de
edad. Los ratones anestesiados (Avertin, 250 mg/kg, ip)
fueron perfundidos con solución salina y las arterias aortas
torácicas se sometieron a digestión con colagenasa,
seguidos de lavados y centrifugaciones para la obtención
del cultivo primario de VSMCs. A partir de este cultivo
primario se obtuvieron nuevas VSMCs de aorta de ratón
con IR (IRLoxP+/+ VSMCs), sin IR (IR-/- VSMCs), y líneas
celulares que expresan específicamente la isoforma A
(IRA VSMCs) o la isoforma B (IRB VSMCs). Para ello, el
cultivo primario de IRLoxP+/+ VSMCs fue transfectado por
infección retroviral (partículas virales que contienen el
vector retroviral pBabe codificando el antígeno largo T de
SV40) y seleccionado con puromicina 1 µg/mL durante 3
semanas. Las IRLoxP+/+ VSMCs inmortalizadas fueron
infectadas con adenovirus que codifican la recombinasa
Cre para obtener IR-/- VSMCs. Finalmente, las IR-/-
VSMCs fueron transfectadas por infección retroviral
(partículas virales que contienen el vector retroviral pBabe
codificando las isoformas individuales del IR humano,
IRA o IRB) y seleccionadas con higromicina 200 µg/mL
durante 2 semanas para obtener IRA VSMCs o IRB
VSMCs, respectivamente.
Las líneas celulares se cultivaron en medio de cultivo
DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino
(FBS) a una temperatura de 37ºC y una atmósfera al 5% de
CO2. Las células fueron privadas de suero durante 4-5
horas para los experimentos de señalización o 18 horas
para los ensayos de migración o de expresión de mRNA y