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Regulación
de
la
neurotransmisión
glicinérgica…

2.
3.
Transporte
de
glicina
tritiada
en
sinaptosomas

Tras
el
correspondiente
tratamiento
de
los
sinaptosomas
con
PGE2
u
otro

compuesto,
se
midió
la
glicina
tritiada
incorporada
en
estos.
Así,
se
añaden
40
µg

de
sinaptosomas
por
condición
(utilizando
como
mínimo
cuadruplicados)
a
medio

HBM
atemperado
a
37ºC
que
contiene
NFPS
10
µM
(para
inhibir
GlyT1)
y
2µl/ml

de
[3H]-­-glicina,
1.6
TBq/mmol
(PerkinElmer
Life
Sciences),
diluida
isotópicamente

una
concentración
de
10µM.
Tras
10
minutos
de
incubación
en
agitación
a
37ºC,
se

lavaron
con
phosphate-­-buffered
saline
(PBS)
(NaCl
137
mM,
0.9mM
CaCl2,
2.68mM

KCl,
1.47
mM
KH2PO4,
0.49mM
MgCl2,
7.37
mM
Na2HPO4,
pH
7.4)
para
retirar
la

[3H]-­-glicina
no
incorporada
al
interior
de
los
sinaptosomas.
El
transporte
de
GlyT2

se
mide
como
la
diferencia
entre
la
acumulación
de
[3H]-­-glicina
a
10
µM,
restando

la
acumulación
obtenida
en
presencia
del
inhibidor
específico
de
GlyT2
(ALX-­-
1393)
que
correspondería
al
transporte
basal
de
los
sinaptosomas.

2.
4.
Inmunoprecipitación
anti-­-multi
ubiquitina

Se
separaron
200
ug
de
sinaptosomas
por
condición,
que
fueron
lisados
en

buffer
de
lisis
conteniendo
NP-­-40
0,25%,
NaCl
150mM,
Tris-­-HCl
25mM
y
N-­-
Etilmaleimida
50mM.
Tras
30
minutos
a
temperatura
ambiente
en
agitación,
se

centrifugaron
las
diferentes
muestras
para
retirar
restos
celulares
no
solubilizados

y
se
incubaron
una
hora
a
temperatura
ambiente
en
presencia
de
un
anticuerpo

anti-­-multi
ubiquitina
unido
a
agarosa
(clon
FK2).
Las
proteínas
ubiquitinadas
se

aislaron
por
precipitación
de
la
agarosa
mediante
una
centrifugación
suave
(8000

r.p.m.,
3
min),
se
eluyeron
a
75ºC
durante
10
minutos
y
se
cargaron
en
un
gel
SDS-­-
PAGE,
revelando
por
western
blot
la
cantidad
de
GlyT2
ubiquitinado.

2.
5.
Análisis
estadístico

Los
datos
se
muestran
como
medias
±
error
estándar
de
la
media
(Standard

Error
Mean,
SEM).
Las
diferencias
estadísticas
entre
dos
grupos
se
determinaron

por
una
prueba
t
de
Student,
mientras
que
la
comparación
entre
más
de
dos

grupos
se
realizó
mediante
el
análisis
de
la
varianza
(ANOVA,
ANalysis
Of

VAriance,
según
terminología
inglesa).
P
<
0,05
se
consideró
significativo,
y
es

denotado
con
*.
Otras
equivalencias
son
**
para
P
<
0,01
y
***
para
P
<
0,001.

3.
RESULTADOS

3.1.
PGE2
activa
la
recaptación
de
glicina
mediada
por
el
transportador
GlyT2

a
través
de
la
activación
de
los
receptores
EP3

Teniendo
en
cuenta
el
papel
crítico
que
juega
GlyT2
en
la
neurotransmisión

glicinérgica
(21)
y
la
regulación
que
PGE2
produce
sobre
la
misma
(14),
nos

preguntamos
si
la
actividad
de
GlyT2
se
vería
afectada
junto
a
la
del
receptor
de

glicina,
modulando
de
manera
coordinada
el
proceso
desde
las
neuronas
pre-­-
y

postsinápticas.
Para
ello
medimos
la
actividad
específica
de
GlyT2
en
sinaptosomas

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