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J.
de
Juan-­-Sanz
&
col.

2.
MATERIAL
Y
MÉTODOS

Las
ratas
tipo
Wistar
fueron
mantenidas
en
condiciones
estándar
en
el

Centro
de
Biología
Molecular
Severo
Ochoa,
siguiendo
las
pautas
actuales
en
el
uso

de
animales
en
la
investigación
en
Neurociencia.
La
glicina
tritiada
([3H]-­-glicina)
se

obtuvo
en
PerkinElmer
Life
Sciences
y
NFPS
(inhibidor
de
GlyT1)
y
ALX-­-1393

(inhibidor
de
GlyT2)
fueron
adquiridos
en
Sigma-­-Aldrich.
PGE2
y
TCS250
se

obtuvieron
de
Tocris
Biosciencie
mientras
que
Beraprost,
Butaprost
y
Sulprostona

se
obtuvieron
de
Cayman
Chemical,
de
donde
provienen
también
los
anticuerpos

específicos
anti-­-EP1,
EP2,
EP3
y
EP4.
El
anticuerpo
para
calnexina
fue
de
Stressgen,

anti-­-multi
Ubiquitina
unido
a
agarosa
se
obtuvo
de
MBL
international
y
el

anticuerpo
anti
GlyT2
fue
producido
en
el
laboratorio
(3).

2.
1.
Electroforesis
y
Western
Blot

Tras
medir
la
concentración
de
proteínas
en
las
distintas
muestras
por
el

método
de
Bradford,
estas
fueron
sometidas
a
electroforesis
en
un
gel
de
SDS-­-
PAGE
utilizando
geles
concentrador
(4%)
y
separador
(7,5%).
Las
muestras
fueron

transferidas
a
membranas
de
nitrocelulosa
por
electrotransferencia
semiseca
(Life

Technologies,
Inc.;
1,2
mA.cm-­-2
1
h),
se
bloquearon
con
leche
5%
en
PBS
durante
1

h
a
temperatura
ambiente
y
se
incubaron
con
los
distintos
anticuerpos
de
interés
a

las
concentraciones
indicadas
por
los
fabricantes,
a
4ºC
durante
la
noche.
Tras

varios
lavados,
los
anticuerpos
unidos
se
detectaron
con
IgGs
unidas
a
peroxidasa,

especificas
para
la
detección
de
la
especie
en
la
que
se
obtuvo
el
primario.
Las

bandas
se
visualizaron
por
ECL
(VWR
International,
Canada).
El
análisis

cuantitativo
de
las
bandas
se
realizó
por
densitometría
en
un
densitómetro
GS-­-800

de
BioRad
utilizando
el
software
Quantity
One
4.6.

2.
2.
Obtención
de
sinaptosomas
purificados
de
médula
espinal
de
rata

Se
sacrificaron
6-­-8
ratas
adultas
por
intoxicación
con
monóxido
de
carbono.

Se
decapitaron
y
se
extrajeron
las
médulas
espinales.
Tras
un
homogeneizado
en

potter
tipo
Dounce
vidrio-­-vidrio,
se
realizaron
las
siguientes
centrifugaciones
a
4ºC

en
rotores
JA.25.50
de
Beckman:
a)
4
min,
5500
r.p.m.
y
se
recuperó
el

sobrenadante,
b)
15
min,
14000
r.p.m.
se
retiró
el
sobrenadante
y
se
resuspendió

el
sedimento
en
buffer
sacarosa
0,32
M
pH
7,4.
c)
7
min,
17000
r.p.m.,
tras
colocar

la
muestra
en
un
gradiente
discontinuo
(25%
-­-
15%
-­-
5%)
de
Percoll
(Sigma)

disuelto
en
buffer
sacarosa
0,32
M
pH
7,4.
Se
recuperó
la
interfase
entre
15-­-25%
y

se
resuspendió
en
HBM
(ClNa
140
mM,
ClK
5
mM,
Cl2Ca
1mM,
Cl2Mg
1mM,

Na2HPO4
1mM,
HNaCO3,
HepesNaOH
pH
7,4
20mM,
Glucosa
10mM)
para
realizar

dos
nuevas
centrifugaciones
que
lavan
el
sedimento
de
Percoll
d)
15
min,
15000

r.p.m.
y
e)
10
min
5500
r.p.m.
Se
resuspendió
en
HBM,
se
midió
proteína
por

Bradford
y
se
ajustó
a
2
mg/ml.

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