Page 76 - 77_04

J.
M.
ZAPICO

y
col.

2.5.
Estudios
de
modelado
molecular

Estudios
de
docking:
GLIDE
(grid-­-based
ligand
docking
with
energetics)
(38).

La
diana
utilizada
para
los
estudios
de
docking,
ha
sido
la
estructura

resuelta
por
RMN
del
dominio
catalítico
de
la
MMP2
con
un
inhibidor
de
tipo

hidroxamato,
el
compuesto
i52
(1hov.pdb)
(39).
Para
estos
estudios,
se
ha

utilizado
el
modelo
1
de
la
estructura
depositada
en
el
pdb,
de
acuerdo
con
los

resultados
obtenidos
en
estudios
previos
con
esta
misma
diana
(40,
41).
Esta

estructura
se
optimiza
y
minimiza
usando
la
aplicación
Protein
Preparation

Wizard
intregrada
en
el
paquete
de
GLIDE.
Seguidamente,
se
crean
los
mapas
de

interacción
del
sitio
activo
de
la
MMP-­-2
usando
la
aplicación
Receptor
Grid

Generation
y
se
selecciona
al
ligando
i52
como
centro
de
la
caja.
Todos
los

compuestos
a
estudiar
se
preparan
usando
la
aplicación
Ligprep.
El
campo
de

fuerzas
OPLS-­-2005
se
selecciona
para
la
preparación
de
ambos,
proteína
y

ligandos.
Los
estudios
de
docking
se
establecen
para
llevarse
a
cabo
de
forma

aleatoria.

Para
cada
estudio
se
selecciona
que
el
programa
busque
10.000

conformaciones
por
pose
(o
solución
de
docking)
y
un
número
máximo
de
10

poses
por
compuesto.
El
método
seleccionado
para
el
estudio
es
el
XP
(Extra-­-
Precision)
docking
(42).

2.6.
Zimografía

Como
fuente
de
gelatinasas
se
emplea
suero
de
sangre
humana

perteneciente
a
voluntarios
sanos.
En
cada
pocillo
del
gel
para
zimografía,
con
un

10%
de
gelatina,
se
añade
la
misma
cantidad
de
suero
(1,5 µl)
(Invitrogen,

Carlsbad,
CA,USA).
Tras
la
electroforesis,
el
gel
se
incuba
durante
30
min
en
un

tampón
renaturalizante
y
otros
30
min
en
un
tampón
de
revelado,
ambos
a

temperatura
ambiente.
A
continuación,
los
geles
se
cortan
en
líneas
individuales
y

se
incuban
en
presencia
de
los
inhibidores
en
el
tampón
de
revelado
toda
la
noche

a
37
ºC.
Tras
varios
lavados
los
fragmentos
del
gel
se
revelan
con
Simply
Blue

(Invitrogen),
se
elimina
el
revelador
y
se
escanean
con
Odyssey
(Li-­-cor,
Lincoln,

Nebraska,
USA).
La
actividad
sobre
la
gelatina
de
cada
enzima
(MMP2,
72
kDa;

MMP9,
92
kDa)
se
cuantifica
por
análisis
de
imagen
(Image-­-J,
NIH,
Bethesda,
MD,

USA)
y
los
valores
de
CI50
se
calculan
con
MS
Excel
en
XLfit
(IDBS,
UL,
Vs.
5.0).

2.7.
Ensayo
de
inhibición
en
MMPs

Las
medidas
de
actividad
en
las
diferentes
MMPs
se
lleva
a
cabo
usando
el

ensayo
colorimétrico
comercial
MMP
Inhibitor
Profiling
Kit
(Enzo
Life
Science

International,
Inc.).
La
absorbancia
se
mide
a
414
nm
(microplate
photometer

Thermo
Scientific
Multiscan
FC).
La
reacción
enzimática
se
lleva
a
cabo
a
37
ºC.
Las

correspondientes
MMPs,
se
incuban
por
triplicado
con
al
menos
seis

106