Page 34 - 74_02

ANA I. GUZMÁN-ARÁNGUEZ Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

membrana se incuba durante una hora con tampón PBS, para ser in-
cubado a continuación con el anticuerpo primario (FGFR3) a una
dilución 1:1000 durante 18 horas a 4º C. Tras el lavado, se incuba con
el anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa (anti IgG HRP de ra-
tón a dilución 1:1000), durante una hora. Tras el lavado, en condicio-
nes idénticas a las del primer anticuerpo, el revelado de la membrana
se realiza utilizando el kit comercial de ECL (Enhanced ChemiLumi-
niscence; Amersham) basado en la emisión de luz por la oxidación de
luminol (una diacilhidrazida cíclica) en presencia de H2O2 catalizada
por la peroxidasa conjugada al segundo anticuerpo. La exposición de
una película fotográfica (Hyperfilm-ECL; Amersham) a la membrana
permite la detección de las bandas proteicas reconocidas por el anti-
cuerpo tras el revelado de la película (líquidos de revelado de AGFA).

Estudio de la cascada de las MAP kinasas
(isoformas ERK1 y ERK2)

Para el estudio de la cascada de las MAP kinasas se partirá de
células, bien sean condrocitos normales, acondroplásicos o células
inmortalizadas y transfectadas con el receptor FGFR3 normal y
mutado (acondroplásico). Se hará especial énfasis en la detección de
las proteínas ERK1 y ERK2 por medio de un anticuerpo comercial
frente al residuo Tyr204, presente en las dos isoformas. Las células
serán sembradas en pocillos a razón de un millón de células por
pocillo, para ser lavadas con pervanadato y así inhibir la actividad
tirosina fosfatasa.

Las células tratadas serán lisadas y centrifugadas a 13.000xg,
10 minutos, a 4º C. 5 µg de proteína se mezclan con tampón de elec-
troforesis y se desnaturaliza 5 minutos a 100º C, para ser corridos en
un gel de poliacrilamida al 10% (v/p) y SDS durante 100 minutos.
Tras la electroforesis, los geles se equilibran durante 30 minutos en
tampón de transferencia y se transfieren durante dos horas a una
membrana de PVDF. La membrana se incuba durante una hora con
tampon TBS, para ser incubado a continuación con el anticuerpo
primario (ERK1) a una dilución 1:1000 durante 18 horas a 4º C. Tras
el lavado, se incuba con el anticuerpo secundario ligado a la peroxi-
dasa (anti IgG HRP de ratón a dilución 1:1000), durante una hora.

212