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VOL. 74 (2), 203-228, 2008 UNA APROXIMACIÓN FARMACOLÓGICA...

Inmunocitoquímica

Los condrocitos se adhieren a coverslips para posteriormente ser
fijados con paraformaldehído al 4% y ser tratados con la solución de
bloqueo durante una hora (para evitar la unión inespecífica). Tras
realizar dos lavados con PBS-BSA, se incuba con el anticuerpo pri-
mario (dilución 1:1000) del receptor purinérgico correspondiente o
el del FGFR3. Se lava tres veces diez minutos para pasar a poner el
anticuerpo secundario marcado con fluoresceína o rodamina duran-
te una hora. Se lava a continuación tres veces (10 min.) de nuevo
con PBS-BSA. El montaje se realiza añadiendo 5 mL de medio de
montaje sobre el porta y esperando a su secado. Las muestras se
visualizan en el microscopio confocal Zeiss (Axiovert 200) con un
módulo confocal Pascal.

Estudios de la movilización del calcio citosólico

Las medidas de calcio intracelular se realizan fijando las células
a cubreobjetos con poli-L-Lys durante una hora a 37º C seguidas de
una incubación con 5 µM FURA2-AM o FLUO3-AM durante un tiem-
po que oscila entre 30 y 45 minutos. Después de ese tiempo las cé-
lulas lavadas y los cubreobjetos son montados en una cámara de per-
fusión para ser estimuladas por los diferentes mono y dinucleótidos.
La fliuorescencia fue observada por medio de un microscopio con-
focal Zeiss LSM Pascal o bien por uno Nikon conectado a una cáma-
ra CCD. La transformación de la fluorescencia en concentraciones
intracelulares de calcio se realizó empleando la ecuación de Gryn-
kiewicz (31).

Western blot

Las células se lisan y centrifugan a 13.000xg, 10 minutos, a 4º C,
5 µg de proteína se mezclan con tampón de electroforesis y se desna-
turaliza 5 minutos a 100º C para ser corridos en un gel de poliacrila-
mida al 10% (v/p) y SDS durante 100 minutos. Tras la electroforesis,
los geles se equilibran durante 30 minutos en tampón de transferen-
cia y se transfieren durante dos horas a una membrana de PVDF. La

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