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JOSÉ-PÍO BELTRÁN Y COLS. ANAL. REAL ACAD. NAC. FARM.

sory for bacterial and fungal electro-transformation (BioRad) en el
caso de E. coli, y según Wen-jun y Forde (33) en el caso de A.
tumefaciens. Tras descongelar en hielo una alícuota de 40 µl de cé-
lulas competentes preparadas mediante sucesivos lavados de glice-
rol, se añadió 1 µl de vector transformante. La mezcla se introdujo
en una cubeta de 0,1 cm de separación entre electrodos (BioRad),
previamente enfriada en hielo, y se sometió a un pulso eléctrico con
un aparato Gene PulserTM (BioRad). Las condiciones de electropo-
ración fueron 200 Ù, 25 µF y 1,8 kV, para E. coli, y 400 Ù, 25 µF y
1,8 kV, para A. tumefaciens. Después del pulso eléctrico se añadió 1
ml de medio LB y se incubó 1 hora a 37ºC y a 200 rpm para E. coli,
y 3 horas a 28ºC y a 200 rpm para A. tumefaciens.

La selección de recombinantes bacterianos se llevó a cabo me-
diante la siembra de las células bacterianas transformadas en placas
con medio LB suplementado con el antibiótico al cual confería re-
sistencia el plásmido en estudio, y en el caso de que el plásmido
permitiese la selección por color, se añadía 40 µl (25 mg/ml) de IPTG
y 25 µl (20 mg/ml) de X-Gal al medio de cultivo sólido.

4. Diseño de la construcción pBI-PsEND1::barnasa-barstar.

Para ensayar si la expresión del gen citotóxico barnasa en aque-
llos tejidos de la antera donde PsEND1 es activo, era capaz de pro-
ducir androesterilidad en plantas transgénicas de Arabidopsis y taba-
co, se realizó la construcción pBI-PsEND1::barnasa-barstar. Para ello
se partió de la construcción pBI101-F3 (13). Esta construcción con-
tenía 2.731 pb de la región promotora de del gen PsEND1 aislada del
rastreo de una genoteca genómica de guisante. La región compren-
día desde el fragmento –2.736 hasta el nucleótido –6 de la región 5’,
tomándose como nucleótido +1 el primer nucleótido del cDNA ais-
lado previamente (clon 162) de una genoteca de cDNA de flores de
guisante. El fragmento –2.736/-6 de la región promotora del gen
PsEND1 estaba fusionado al gen uidA que codifica la enzima ß-
glucuronidasa (GUS), (13). Este gen fue liberado con las enzimas de
restricción BamHI y SacI y el fragmento correspondiente al plásmi-
do pBI101 más el promotor del gen PsEND1 fue extraído del gel de
agarosa. El fragmento barnasa-barstar previamente clonado en el

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