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VOL. 73 (4), 1237-1164, 2007 ANDROESTERILIDAD INDUCIDA MEDIANTE...

utilización. Las muestras incluidas en parafina se seccionaron en un
microtomo rotatorio Microm (secciones de 7-10 µm de grosor). Los
cortes obtenidos se depositaron sobre portaobjetos tratados con
TESPA (Sigma) como adherente. Las secciones de tejidos incluidos
en parafina una vez sobre los portas, se desparafinaron en Histo-
Clear durante 10 min. y luego se rehidrataron en soluciones decre-
cientes de etanol/agua (100%, 70%, 50%), durante 1 min. en cada
una y finalmente se lavaron con agua destilada. Posteriormente se
realizó la inmunolocalización de la proteína PsEND1 bloqueando las
secciones con BSA al 5% en PBS e incubándolas a continuación con
un anticuerpo primario anti-PsEND1 diluido al 0.1% durante 2h (3).
Luego se realizaron varios lavados con PBS y se incubaron con un
anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (Anti-IgG-FITC).
Finalmente las preparaciones se montaron permanentemente con un
anti-fading. Las observaciones y fotografías se realizaron con un
microscopio confocal (Leica, TCS SL).

Para ser utilizadas en SEM, las muestras almacenadas en etanol
del 100%, se desecaron con CO2 líquido en un aparato secador de
punto crítico Polaron E300, se montaron en portaobjetos metálicos
con cinta adhesiva de carbono activado sobre los que fueron orien-
tadas y diseccionados convenientemente. Después del montaje, las
muestras fueron recubiertas con un sombreado de partículas de oro-
paladio de 200 nm, en atmósfera de argón ionizado en un Sputter
Coater SCD005 (BALTEC). Las imágenes se obtuvieron mediante el
programa Autobeam de la plataforma ISIS (Oxford Instruments),
con una velocidad de barrido de 200 s por imagen, en un microsco-
pio electrónico de barrido JEOL JSM-5410 operando bajo las condi-
ciones de microanálisis de 10 kV y distancia de trabajo de 25 mm.

3. Transformación de bacterias: preparación de células
competentes y electroporación

Las cepas que se emplearon en las transformaciones fueron la
DH5a de Escherichia coli y las cepas Agrobacterium tumefaciens C58
pMP90 (21) y LBA4404 (17). La preparación de células competentes
para su transformación mediante electroporación se llevó acabo
según los protocolos descritos en el catálogo Pulse controller: Acce-

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