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VOL. 73 (4), 1237-1164, 2007 ANDROESTERILIDAD INDUCIDA MEDIANTE...

sitio BamHI del plásmido pBluescript KS (+) (Stratagene), fue am-
plificado utilizando los cebadores Ribo 1 (5’-TAGGATCCCGACCAT-
GGCACAGGTTATC-3’) e Inhi 2 (5´-GCGAGCTCTTAAGAAAGTTGAT-
GGTGATG-3´). Con el primero se mantiene el sitio de corte para la
enzima BamHI del clon original a nivel del ATG de la barnasa, y con
el último se crea un sitio de corte para SacI a nivel del codón de
parada del gen barstar. El fragmento producto de la reacción de
PCR, se ligó al vector pGEM-T Easy (Promega), y se liberó posterior-
mente con las enzimas BamHI y SacI. Este inserto fue clonado en el
sitio que crearon estas mismas enzimas en la construcción pBI-
PsEND1, creándose así la construcción pBI-PsEND1::barnasa-bars-
tar. La barnasa es una ribonucleasa muy activa e incluso a bajo
niveles de expresión en E. coli o Agrobacterium puede impedir el
normal desarrollo y la supervivencia de las bacterias. Por este mo-
tivo se introduce en la construcción el gen barstar que produce un
inhibidor de la barnasa e impide la muerte de las bacterias. El gen
bastar no se expresa en estas condiciones en la planta (14).

5. Transformación de Arabidopsis thaliana y análisis
de las plantas transgénicas

Para la producción de plantas transgénicas de Arabidopsis thalia-
na se ha utilizado la planta silvestre del ecotipo Columbia (Col). La
transformación se realizó siguiendo el protocolo de infiltración al
vacío (2). Cuando las silicuas de las plantas transformadas estuvie-
ron maduras se recogieron las semillas, se guardaron en bolsas de
celofán y se incubaron en una estufa a 37ºC durante al menos una
semana. Para la selección de los transformantes primarios (T1), las
semillas procedentes de plantas individuales T1 se esterilizaron, se
sembraron en cajas Petri de 15 cm. de diámetro con medio de selec-
ción con kanamicina y se cultivaron en cabinas de cultivo in vitro.
Después de 7-10 días desde la siembra, los transformantes eran cla-
ramente identificables por su color verde y sus raíces desarrolladas;
en ese momento se transplantaron a alvéolos (6,5 x 6,5 x 5 cm) con
una mezcla turba:vermiculita:perlita (1:1:1) y se trasladaron a un
fitotrón para su cultivo bajo las condiciones descritas anteriormente.

Se analizó el fenotipo de la población correspondiente a la prime-
ra (T1) y segunda generación (T2) de plantas transformadas con la

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