Page 437 - 73_04

VOL. 73 (4), 1237-1164, 2007 ANDROESTERILIDAD INDUCIDA MEDIANTE...

7. Transformación de Nicotiana tabacum y análisis
fenotípico de las plantas transformadas

La transformación de plantas de Nicotiana tabacum se realizó
siguiendo el método descrito por Horsh et al., (19), con las modifi-
caciones propuestas por Fisher y Guiltinan (9). Los brotes regenera-
dos (uno de cada explante, para asegurar que se seleccionaban su-
cesos de transformación independientes) que iban apareciendo se
cortaban evitando el callo y se transferían a frascos de 6 cm. de
diámetro por 9,5 cm. de altura con medio de enraizamiento MS-
SACK (medio MSS sólido con 0,2 mg/l de IAA, 200 mg/l de carbeni-
cilina y 130 mg/l de kanamicina). De cada brote enraizado, se aisla-
ban dos entrenudos, cada uno con una hoja, que se transferían a
frascos de medio MSSABCK, a partir de los cuales se regeneraban
dos plantas completas. Una de ellas se utilizó para mantener una
réplica en cultivo in vitro, mientras que la otra, una vez enraizada,
se transfería a tierra. Para ello, los brotes enraizados se extrajeron
de los frascos, se les eliminó los restos de medio de las raíces, se
transplantaron a macetas de 13 cm. de diámetro con una mezcla de
turba:vermiculita (1:1) y se trasladaron al invernadero, donde se
cultivaron bajo las condiciones descritas anteriormente. El análisis
fenotípico de la primera generación (T1) de plantas PsEND1::barnasa
se llevó a cabo mediante del análisis de la morfología de las anteras
de estas plantas por medio de fotografías realizadas con una cámara
Nikon F-601 M, acoplada a una lupa MZ8 (Leica) y mediante la
observación de las anteras a través de SEM y microscopía óptica.

8. Transformación de colza (Brassica napus L.) y análisis
8. de las plantas transgénicas.

Se utilizaron plantas de colza del cv. Drakkar que se transforma-
ron con la cepa C58C1 ATHV (18) de Agrobacterium siguiendo el pro-
tocolo de Damgaard et al. (5) con algunas modificaciones. Tras un
periodo de 2 días de precultivo los explantos de hipocotilo se corta-
ron en segmentos de 5 mm y se incubaron durante 60 min en medio
MS-CIM-G (MS combinado con 20 g l-1 glucosa, 1 mg l-1 2, 4-D, 0.1
mg l-1 IAA) conteniendo 1 x108 células de Agrobacterium por ml-1.
Luego, el medio fue reemplazado por medio líquido fresco MS-CIM-

1247