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VOL. 73 (3), 725-746, 2007 FARMACOLOGÍA DE TERPENOIDES DE HELIANTHUS...

éster de forbol TPA (13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol) (Sigma)
(2,5 µg/oreja) disuelto en acetona, en cada superficie (interna y ex-
terna) de la oreja derecha de todos los ratones Swiss machos (25 ±
3 g), agrupados en lotes de seis animales. Simultáneamente, se apli-
có en la misma oreja el producto de referencia (indometacina) (0,25,
0,5 y 1,0 mg/oreja) o el compuesto problema (0,25, 0,5 y 1,0 mg/
oreja), utilizando como vehículo acetona. Se aplicó el mismo vo-
lumen del vehículo (acetona) en la oreja izquierda (control). A las
cuatro horas se procedió al sacrificio de los animales mediante dis-
locación cervical para obtener a continuación, mediante un sacabo-
cados, secciones de 6 mm de diámetro de la porción central de las
orejas. El edema producido en cada ratón se midió mediante la
diferencia de peso entre la oreja tratada y la oreja control. Estas
muestras fueron utilizadas a continuación para la determinación de
la actividad de la enzima mieloperoxidasa.

Determinación de la actividad mieloperoxidasa

La actividad de esta enzima, contenida en los lisosomas de neu-
trófilos, es un indicador de la presencia de estos leucocitos en los
exudados inflamatorios, por lo que su determinación a partir de las
secciones de oreja obtenidas en el ensayo anterior, indica el grado
de infiltración de neutrófilos que ha tenido lugar durante el desarro-
llo del ensayo. Después de homogenizar las secciones de las orejas
(40 segundos) en 1,5 mL de suero fisiológico, se centrifugaron a
10.000 g durante 15 minutos a 4° C. La actividad mieloperoxidasa
se midió en los sobrenadantes según el método descrito por Gil y
cols. (10). La reacción se realizó en placas de 96 pocillos, y para ello
se añadió a 50 µL de sobrenadante, 150 µL de tampón fosfato PBS
(NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4 8,1 mM),
15 µL de NaH2PO4 (0,22 M, pH 5,4), 20 µL de H2O2 (0,034%) y 20 µL
de tetrametilbencidina (Sigma) (18 mM en dimetilformamida al 8%).
Después de una incubación de tres minutos a 37° C, se detuvo la
reacción con 30 µL de tampón acetato sódico (1,46 M, pH 3,0) mi-
diéndose las absorbancias (densidades ópticas) a 630 nm en un lec-
tor de placas (Digiscan mod. 6010152EU, Asys Hitech). Los resulta-
dos se expresan como absorbancias a esta longitud de onda, del lote
control y de los diferentes lotes problema.

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