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RODRIGO EUGENIO DÍAZ VICIEDO AN. R. ACAD. NAC. FARM.

Generación de PGE2

Se cultivaron macrófagos de la misma manera anterior, en placas
de 24 pocillos (0,5 × 106 células/mL). Después de incubar por un
periodo de 18 horas aproximadamente, se procedió a reponer el
medio de cultivo, se pretrató con los compuestos en estudio y final-
mente se estimuló con LPS/IFN-?. Después de 16 horas de incuba-
ción, se recogen los sobrenadantes y se procede a medir los niveles
de PGE2 utilizando para ello el kit comercial Prostaglandin E2 Bio-
trak Enzymeimmunoassay (EIA) System, siguiendo las instrucciones
y recomendaciones indicadas por el proveedor (Amersham Bioscien-
ces). Cabe destacar que los niveles totales de PGE2 cuantificados en
este experimento son el producto de la actividad conjunta de la COX-
1 y de la COX-2.

Ciclooxigenasa-1 (COX-1)

Los macrófagos (106 células/mL) fueron sonicados a 4° C en un
ultrasonicador a máxima potencia. Los microsomas fueron prepara-
dos por centrifugación (2.000 g, 5 min., 4° C), seguido de una ultra-
centrifugación del sobrenadante (100.000 g, 100 min., 4° C) (6). Los
microsomas obtenidos (20 µg/tubo) se preincuban durante 15 mi-
nutos en 50 mM de tampón Tris-HCl, pH 7,4, con hematina (2 µM),
L-triptófano (1 mM) y con los compuestos problema. Transcurrido
este tiempo, se adiciona ácido araquidónico (100 µM) y se incuba a
37° C durante 30 minutos. La reacción se detiene por calentamiento
a 90° C durante cinco minutos. Los niveles de PGE2 fueron determi-
nados por EIA.

Ciclooxigenasa-2 (COX-2)

Los macrófagos (106 células/mL) fueron resuspendidos en medio
de cultivo RPMI 1640 con aspirina (300 µM) e incubados a 37° C
durante dos horas. Se realizó un lavado dos veces, para luego resus-
penderlas en medio RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino e in-
cubadas con LPS/IFN-? a 37° C durante 24 horas. Después de una
centrifugación (800 g, 5 min., 4° C) las células fueron sonicadas a

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