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RODRIGO EUGENIO DÍAZ VICIEDO AN. R. ACAD. NAC. FARM.

Materiales de cultivo celular

El cultivo de la línea de macrófagos de ratón RAW 264.7 utili-
zados para los siguientes experimentos se realizó en un incubador a
37° C en atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO2
en placas Petri estériles de 10 mL (Sarstedt). El medio de cultivo
utilizado fue RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (Cf = 2 mM),
suero bovino fetal (Cf = 10%), penicilina-estreptomicina (Cf = 2%),
gentamicina (Cf = 0,4%) y L-arginina (Cf = 1 mM). Todos los produc-
tos señalados anteriormente son de Gibco, con excepción de la L-ar-
ginina (Sigma).

Estudio de la toxicidad celular

Una vez obtenidos los macrófagos mediante rascado de una placa
Petri y posterior centrifugación (800 g, 5 min, ta ambiente), se realizó
el recuento de los mismos y se resuspendieron en medio de cultivo
a una concentración de 0,5 × 106 células/mL. Se distribuyeron alí-
cuotas de 200 µL en placas estériles de 96 pocillos (Sarstedt), y se
incubaron durante dos horas para permitir su adherencia al fondo
de la placa, tras lo cual se reemplazó el medio con el fin de eliminar
las células no adheridas. Las células se trataron con los compuestos
objeto de estudio a distintas concentraciones (concentración final de
DMSO < 0,001%) durante un periodo de incubación de 24 horas. A
continuación, se determinó la viabilidad de estas células, para estu-
diar el posible efecto tóxico del compuesto, mediante la cuantifica-
ción de la respiración mitocondrial a través de la reducción de MTT
(bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma) a
formazán, siguiendo el método descrito por Scudiero (11). Para ello,
se sustrajeron 100 µL del medio de cultivo de cada pocillo, adicio-
nando a continuación 20 µL de MTT estéril (2 mg/mL en tampón
PBS). Tras incubar una hora a 37° C se eliminó el medio y se aña-
dieron 100 µL de DMSO a cada pocillo, para solubilizar los cristales
de formazán formados. La formación de formazán se determinó es-
pectrofotométricamente a 550 nm en un lector de placas (Digiscan
mod. 6010152EU, Asys Hitech). Los resultados se expresan como %
de viabilidad respecto a las células sin tratar, que representan el
100% de viabilidad (12).

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