Page 107 - 73_03

VOL. 73 (3), 725-746, 2007 FARMACOLOGÍA DE TERPENOIDES DE HELIANTHUS...

Generación de óxido nítrico (NO)

Se prepararon los macrófagos en las mismas condiciones que el
ensayo anterior, distribuyéndose alícuotas de 200 µL (0,5 × 106 cé-
lulas/mL) en placas estériles de 96 pocillos. Después de incubar du-
rante 24 horas se reemplazó el medio con el fin de eliminar las
células no adheridas y se añadieron los compuestos problema, incu-
bando las células durante 30 minutos. A continuación se procedió a
estimular a los macrófagos, añadiendo una mezcla del lipopolisa-
cárido LPS [Salmonella typhimurium (Sigma), 0,5 µg/mL] e IFN-?
[murino, (Genzyme), 20 U/mL], continuando la incubación durante
17-20 horas. La concentración de NO liberado al medio se midió de-
terminando la presencia de nitritos con el reactivo de Griess (13). Se
prepararon alícuotas de 100 µL de los medios de cultivo en placas de
96 pocillos, a las que se añadieron 100 µL de reactivo de Griess [1%
de sulfanilamida (Sigma), 5% de H3PO4 y 0,1% de N-[1-naftil]etilen-
diamina (Sigma) en agua destilada]. La absorbancia del cromóforo
resultante se midió en un espectrofotómetro de placas a 540 nm. Las
concentraciones de nitritos en las muestras se calcularon mediante
interpolación de los valores de absorbancia obtenidos en una curva
estándar de NaNO2.

Generación de TNF-a

Se procedió al cultivo de los macrófagos de la misma manera
anterior, pero en este caso se utilizaron placas de 24 pocillos (0,5 ×
106 células/mL). Siguiendo el mismo procedimiento ya descrito para
el pretratamiento con el compuesto problema y la estimulación con
LPS/IFN-?, se procedió a la determinación de los niveles del TNF-a
en los sobrenadantes, basado en una fase sólida ELISA (Enzime-
Linked Inmunosorbent Assay) siguiendo las instrucciones y reco-
mendaciones indicadas por el proveedor (Amersham Biosciences).
Como inhibidor de referencia se utilizó dexametasona (1 µM).

735