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A. GARRIDO, J.M BAUTISTA ANAL. REAL ACAD. NAL. FARM.

de ADN, las enzimas de restricción y la Taq. ADN polimerasa de Biotools.
La Taq. Gold polimerasa y el Kit de aislamiento de plásmidos High Pure
Plasmid Isolation Kit de Perkin Elmer. La proteinasa K de Gibco. Los
Desoxinucleótidos (dNTPs) de Finnzymes OY, Biotools y Ecogen. Los
cebadores, los oligonucleótidos y la Dynazyme de Perkin-Elmer, Cruachem
y Pharmacia-Biotech. Las columnas de Chroma SpinTM de Clontech. El Kit
para la extracción de ARN de Qiagen: El ladder-100TM de Pharmacia-
Biotech. La T4 ADN ligasa y vector pGEM-T de Promega.

Extracción de ADN de células nucleadas humanas. El método seguido ha
sido, fundamentalmente, el descrito por Millar y col. (36). La calidad del
ADN extraído se valoró mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8%
en TAE 1X.

Extracción de ARN total de sangre entera. Para la obtención del ARN de
la sangre se ha utilizado un kit proporcionado por la marca QIAGEN y el
procedimiento seguido fue el descrito en su manual de instrucciones Rneasy
Blood Mini Handbook.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las disoluciones y los tam-
pones que se utilizaron fueron: Tampón de reacción PCR: Tris-HCl, pH 9,0,
75 mM; KCl, 50 mM; KCl; (NH4)2SO4 20 mM y BSA al 0,001%. Disolución
de nucleótidos: Contiene los 4 desoxinucleótidos fosfato (dATP, dTTP,
dCTP y dGTP) a una concentración de 10 mM. Disolución de cloruro de
magnesio: La concentración de MgCl2 es de 50 mM. Disoluciónes de
cebadores (primers): Cada disolución contiene un cebador a una concentra-
ción de 150 mg/ml.

Las secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizados correspon-
dientes a los once exones y el sentido de las cadenas han sido los siguientes:

EXON 1: Directa: 5’ TATTCCATGGTCCCGCAG 3’: Inversa 5’ GGCTCCTAGTTTTCACCCTC

3’. EXON 2: Directa: 5’ GCATGGGGAGGAAGGGCAGG 3’;Inversa:

5’ATAGGCCCTGTGTGGCTGCA 3´

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