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VOL. 69 (1) , DEFICIENCIAS EN PIRUVATO QUINASA

Hibridación específica entre las cadenas del cebador y las de ADN. 4ª.
Temperatura: 72°C. Tiempo: 1 min. Proceso: Elongación de las cadenas
sintetizadas de nuevo. 5ª Temperatura: 72°C. Tiempo: 3 min. Proceso:
Elongación final. 6ª. Temperatura: 4°C. Tiempo: f Proceso : Mantenimiento.
Las etapas 2ª ,3ª y 4ª se repitieron durante 35 ciclos.

La mezcla de reacción y las condiciones del segundo PCR fueron: Mezcla
de la reacción del segundo PCR: Producto de la reacción del primer PCR. 1
µl; tampón de reacción PCR, 10 µl; Mg Cl2 (50 mM), 3 µl; dNTPS, 2 µl;
disolución de EPR, 2 µl; disolución de E8F, 2 µl y agua, 79 µl.

Las condiciones del PCR fueron: 1ª. Temperatura: 95°C. Tiempo: 5 min.
Pasado este tiempo se agregó 1 µl de la Taq polimerasa. 2ª. Temperatura:
94°C. Tiempo: 45 seg. Proceso: Desnaturalización de la doble hélice de ADN
en el proceso cíclico. 3ª. Temperatura: 65° C. Tiempo :45 seg. Proceso:
Hibridación específica entre las cadenas del cebador y las de ADN. 4ª.
Temperatura: 72°C. Tiempo: 1 min. Proceso: Elongación de las cadenas
sintetizadas de nuevo. 5ª Temperatura: 72°C. Tiempo: 3 min. Proceso:
Elongación final 6ª. Temperatura: 4°C. Tiempo: f Proceso : Mantenimiento.
Las etapas 2ª, 3ª y 4ª se repitieron durante 35 ciclos

Secuenciación automática de ADN. El procedimiento de secuenciación de
ADN fue realizado con un secuenciador automático y según el procedimiento
descrito por Sanger (38).

Construcción de modelos moleculares. Los estudios sobre la estructura
tridimensional de las enzimas normal y mutadas están basados en los trabajos
realizados por Allen y Muirhead (39) con difracción de rayos X sobre las
enzimas homólogas cristalizadas de músculo de conejo y de gato. Las
secuencias corregidas de los cADN del gen PK-LR fue alineada con la
secuencia derivada de las estructuras PK-M utilizando el programa “Aligne-
ment of Multiple Protein Sequences” (AMPS) (40). Los programas utilizados
en el estudio de la estructura, la localización de las mutaciones y los efectos
locales de las sustituciones fueron el RasMolv.2.6 y el Swiss Model

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