Page 98 - 69_01

A. GARRIDO, J.M BAUTISTA ANAL. REAL ACAD. NAL. FARM.

Inserción y unión de los productos de PCR al vector pGEM? -T. Para

determinar las secuencias nucleotídicas de los genes los productos de la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron insertados en el plásmido
vector pGEM?-T. El procedimiento seguido ha sido el descrito en el

Technical Bulletin, que acompaña al kit de Promega.

Transformación de células de Escherichia coli con el vector ADN ligado-
pGEM? -T. El material utilizado en esta técnica ha sido: Células de Escheri-

chia coli JM109 (High Efficiency Competent) con genotipo recA1, end A1,

gyrA96, thi, hsdrR17, relA1, supE44, '(lac-proAB),`[F´,traD36, proAB,
lacIqZ'M15]. El procedimiento seguido para la transformación ha sido el
descrito en el Technical Bulletin de Promega.

Aislamiento de los plásmidos conteniendo los insertos. El aislamiento de
los plásmidos conteniendo los insertos fue realizado mediante el método
descrito por Sambrook y col. (37)

Aislamiento y caracterización de los insertos plasmídicos. Para aislar y

caracterizar los fragmentos de ADN insertos en los plásmidos, los vectores
ADN ligado-pGEM?-T fueron digeridos con las enzimas de restricción Pst I

y Sph I, cuyas secuencias objetivo se localizan en el polinker.

Síntesis de ADN mediante la transcriptasa inversa. La síntesis de ADN a
partir de ARN de leucocitos se realizó utilizando un Kit de Promega y
siguiendo las instrucciones descritas en el Kit Transcription System. Los
exones utilizados fueron:

EXON E12-CADN: Inversa: 5´ AGGGTCAGGAATAGAGAAGAGAGG3´

EXON E8-RTPC: Directa: 5´ GATTGGGCGCTGCAACTTGGC3´

EXON E9-RTPCR: Directa: 5´CTCCTCAAACGACTGCCGGTGG3

Las condiciones del PCR fueron: 1ª. Temperatura: 95°C. Tiempo: 5 min.
Pasado este tiempo se agregó 1 µl de la Taq de Biotools. 2ª. Temperatura:
94°C. Tiempo: 45 seg. Proceso: Desnaturalización de la doble hélice de ADN
en el proceso ciclico. 3ª. Temperatura: 60° C. Tiempo :45 seg. Proceso:

114