Page 78 - Demo

captura, se probaron distintos bloqueantes seevaluaron seis posibles agentes bloqueantes:etanolamina (ETA) al 10% en PB de pH 8,alcohol polivin%u00edlico (PVA) al 1% en PBS de pH7,4, case%u00edna al 2% en PBS de pH 7,4, blockingbuffer (BB), BB libre de prote%u00ednas (PFBB) yalb%u00famina de suero bovino (BSA) al 1% en PBSde pH 7,4. Para ello, se valoraron estosbloqueantes en ausencia y presencia dediferentes concentraciones de MMP9depositando 5 %u03bcL de bloqueante sobre elelectrodo previamente modificado con el Acde captura y realizando la medidaelectroqu%u00edmica. La mayor S/B se obtuvo alutilizar como agente bloqueante BSAobteni%u00e9ndose valores de S/B semejantes ymuy inferiores con el resto de los bloqueantesestudiados.Por otro lado, para conocer el valor %u00f3ptimode la concentraci%u00f3n de BSA se estudiarondiferentes concentraciones de BSA entre 0,5 y2,5 %. obteni%u00e9ndose mediante SWV, los valores representados en la Figura 4C.3.4.3 Influencia del tiempo de incubaci%u00f3n deMMP9El tiempo de incubaci%u00f3n de la MMP9 esdeterminante para la respuesta delinmunosensor, por lo que se evaluaron tiemposentre 30 y 75 minutos de la uni%u00f3n MMP9 -Accaptura. Se obtuvo una relaci%u00f3n se%u00f1al/blancoaproximadamente 3 veces superior con untiempo de 60 min.3.4 optimizaci%u00f3n de las variablesexperimentalesCon el fin de obtener la m%u00e1xima sensibilidad yespecificidad del inmunosensor desarrolladose llev%u00f3 a cabo la optimizaci%u00f3n de las variablesexperimentales que implicadas en su preparaci%u00f3n. Para ello, se estudiaron mediante SWVdiferentes par%u00e1metros experimentales, comolas concentraciones de los biorreactivos, tiempos de incubaci%u00f3n y tipos de disoluciones bloqueantes empleados, siendo el valor %u00f3ptimoaquel que ofreciese una mayor relaci%u00f3nse%u00f1al/blanco (S/B).3.4.1 Influencia de la concentraci%u00f3n ytiempo de incubaci%u00f3n del ac de capturaTanto la concentraci%u00f3n como el tiempo deincubaci%u00f3n del Ac de captura son par%u00e1metrosque juegan un papel esencial en la sensibilidady el intervalo lineal del m%u00e9todo anal%u00edtico. Porello, se estudi%u00f3 la influencia de laconcentraci%u00f3n de Ac de captura para valoresde 5, 10 y 15 %u00b5g/mL y el tiempo de incubaci%u00f3nde 15, 30 y 45 min. Los resultados obtenidoscon SWV se representan en las Figuras 4A y4B, respectivamente.3.4.2 Influencia de la etapa de bloqueo: tipoy concentraci%u00f3n de bloqueanteCon el objetivo de prevenir y disminuir en loposible las adsorciones inespec%u00edficas en lasuperficie del electrodo tras fijar el Ac de200ANALESRANFwww.analesranf.coman. r. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 193-206 Label-free electrochemical inmunosensor formetaloproteinase 9 determinationIrene Charneco, Marta S%u00e1nchez, et al.Figura 5. (a) recta de calibrado para la determinaci%u00f3n de MMP9. Condiciones experimentales:edC/NHss, 100 mM, 10ul, 30 min; ac captura, 10 %u00b5g/ml, 5 %u00b5l; bsa 1%, 5 %u00b5l, 30 min; MMP9, 5 %u00b5l, 60min. (b) en el inset se muestran los voltamperogramas de onda cuadrada (swv) para distintasconcentraciones de MMP9.