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196ANALESRANFwww.analesranf.coman. r. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 193-206 Label-free electrochemical inmunosensor formetaloproteinase 9 determinationIrene Charneco, Marta S%u00e1nchez, et al.fosfato (PBS) a pH 7,4 preparada a partir de137 mM NaCl (Labkem), KCl 2,7 mM (Probus),Na2HPO4 8,1 mM (Scharlau) y KH2PO4 1,5 mM(Merck), y una disoluci%u00f3n tamp%u00f3n 2-(N-morfolino)etanosulf%u00f3nico) (MES) 25 mM a pH 5,0(Merck). Todas las medidas electroqu%u00edmicas sellevaron a cabo empleando como sonda redox5 mM Fe(CN) 4%u2212/3%u2212, KCl 0,1 M en una disoluci%u00f3ntamp%u00f3n fosfato 0,1 M, pH 7,4. Para su preparaci%u00f3n se utiliz%u00f3 potasio ferricianuro de potasio (K3Fe(CN)6), potasio hexacianoferrato (II)3-hidrato K4Fe(CN)6%u00b73H2O (Panreac), y clorurode potasio (KCl) (Merck).2.3 Medidas electroqu%u00edmicasLa caracterizaci%u00f3n de las diferentes etapasinvolucradas en la preparaci%u00f3n delinmunosensor se realiz%u00f3 medianteespectroscopia de impedancia electroqu%u00edmicay voltamperometr%u00eda c%u00edclica. Para ladeterminaci%u00f3n de la concentraci%u00f3n de MMP9se emple%u00f3 voltamperometr%u00eda de ondacuadrada.La espectroscopia de impedanciaelectroqu%u00edmica (EIS) es un m%u00e9todo que norequiere marcaje, basado en la generaci%u00f3n deuna se%u00f1al el%u00e9ctrica dependiente de laspropiedades interfaciales entre el electrodo yel electrolito. La velocidad de la transferenciade carga entre el electrodo modificado y unindicador redox se mide como la resistencia ala transferencia de carga (Rct), que se vemodificada en funci%u00f3n de los cambios que seproducen en la superficie electr%u00f3dica (20). Losdatos obtenidos se eval%u00faan, frecuentemente,mediante el gr%u00e1fico de Nyquist, donde serepresenta la impedancia imaginaria frente ala impedancia real. La forma de la curva y elvalor de Rct aportan importante informaci%u00f3nsobre los cambios producidos en la interfazdebido a la adsorci%u00f3n de especies.La voltamperometr%u00eda c%u00edclica (CV) es unat%u00e9cnica vers%u00e1til basada en la aplicaci%u00f3n de unpotencial de variaci%u00f3n lineal, de formatriangular y la monitorizaci%u00f3n simult%u00e1nea dela corriente resultante. El voltaje aplicadovar%u00eda de manera continua y se invierte paradar lugar a un ciclo repetitivo que se vereflejado en un voltamperograma, donde serepresenta la intensidad de corriente enfunci%u00f3n del voltaje aplicado.La voltamperometr%u00eda de onda cuadrada(SWV) es una t%u00e9cnica altamente sensible queconsiste en la aplicaci%u00f3n de dos impulsoscuadrados de la misma amplitud y duraci%u00f3n,de signos opuestos, sobre una variaci%u00f3ncontinua de potencial en forma de rampa. Lacorriente diferencial resultante se calcularestando las dos corrientes sucesivas medidasal final de cada impulso. Por lo tanto, lascorrientes capacitivas y residual se eliminan,aumentando la sensibilidad de la t%u00e9cnica.2.4 dise%u00f1o del inmunosensor electroqu%u00edmico2.4.1 Grafting electroqu%u00edmico y activaci%u00f3nde grupos carbox%u00edlicosEl m%u00e9todo de inmovilizaci%u00f3n empleado para lamodificaci%u00f3n de la superficie del electrodo serigrafiado se basa en la generaci%u00f3n de una salde aril diazonio a partir del %u00e1cido 4-aminobenzoico en presencia de nitrito de sodio enmedio HCl, que se ancla electroqu%u00edmicamentea la superficie electr%u00f3dica mediante un proceso de %u201celectrografting%u201d en una sola etapa,realizando barridos sucesivos mediante voltamperometr%u00eda c%u00edclica de 0 a -1 V.Para que se produzca la diazotaci%u00f3n del%u00e1cido p-aminobenzoico (pABA) con NaNO2enmedio HCl, se disuelven 20 mg de pABA en 2mL de HCl 1 M, enfriando en un ba%u00f1o de hielo.Seguidamente, se prepara la sal de diazonioadicionando gota a gota 380 %u03bcL de NaNO2, 2mM por cada 2 mL de la disoluci%u00f3n de pABA,con agitaci%u00f3n constante en un ba%u00f1o de hielo.A continuaci%u00f3n, se depositan 40 %u03bcL de estadisoluci%u00f3n sobre la superficie de un electrodode carbono serigrafiado y se realizan 10 ciclosmediante CV entre 0 y %u20131 V, a una velocidadde barrido de 200 mV/s. Finalmente se lava elelectrodo abundantemente con agua y se seca con nitr%u00f3geno (Figura 1A y 1B).