Page 80 - Demo

lo hace la concentraci%u00f3n de MMP9. Aunquehasta el momento no se ha encontrado unaexplicaci%u00f3n satisfactoria a este hecho, ya queseg%u00fan la bibliograf%u00eda consultada el puntoisoel%u00e9ctrico de la MMP9 es de 5.7 y cabr%u00edaesperar una repulsi%u00f3n electrost%u00e1tica de lasonda redox en disoluci%u00f3n por parte de lasuperficie electr%u00f3dica cargada negativamenteal pH de trabajo, actualmente se est%u00e1nrealizando estudios encaminados a esclarecereste punto. Se piensa que puede haber unareorganizaci%u00f3n de la capa tras la uni%u00f3n delant%u00edgeno-anticuerpo favoreci%u00e9ndose de estamanera el acceso de la sonda redox Fe(CN)4%u2212/3%u2212.Con la finalidad de verificar la uni%u00f3n delanalito MMP9 al anticuerpo de capturainmovilizado sobre la superficie electr%u00f3dica se realizaron medidas tras incubar la superficie anterior en un anticuerpo de detecci%u00f3n anti-MMP9 biotinilado. Como puede observarse en la figura 3B, la incorporaci%u00f3n de este anticuerpo biotinilado produjo un aumento de la Rct, lo que se atribuye a la mayor dificultad del acceso de la sonda Fe(CN)4%u2212/3%u2212 a la superficie electr%u00f3dica, verific%u00e1ndose de esta forma que la uni%u00f3n de la MMP9 al anticuerpo de captura primero y al anticuerpo de detecci%u00f3n biotinilado despu%u00e9s ha tenido lugar.Los resultados obtenidos por voltametr%u00edac%u00edclica (Figura 2.B) concuerdan con losobtenidos mediante EIS As%u00ed, la intensidad de corriente sobre el electrodo desnudo (SPCE), mostr%u00f3 un pico an%u00f3dico y uno cat%u00f3dico, siendo Ipa de 0,19 mA, y la separaci%u00f3n entre ellos %u0394Ep de 230 mV. Tras el grafting electroqu%u00edmico se produjo un dr%u00e1stico descenso de la intensidad del pico an%u00f3dico (Ipa= 0,02 mA) y un aumento de la separaci%u00f3n entre los potenciales de pico(%u0394Ep= 800 mV), mostrando un procesoirreversible, debido, probablemente, a la gran dificultad de acceso de la sonda Fe(CN)64%u2212/3%u2212 al electrodo ya explicado. Como era de esperar, la adici%u00f3n de EDC/NHS da lugar a un incremento de Ipa (0,07 mA) y a una disminuci%u00f3n de la separacion de picos(%u0394Ep= 420 mV), que concuerda con el descensoconcentraci%u00f3n de MMP9 a%u00f1adida de 1 ng/mL,se obtuvo una concentraci%u00f3n de 0,95%u00b1 0,11ng/mL, correspondiente a una recuperaci%u00f3ndel 95%, siendo de 10,92 %u00b1 1,25 ng/mL cuandola concentraci%u00f3n de MMP9 fue de 10 ng/mL, loque se corresponde con una recuperaci%u00f3n del109,2%. Finalmente, si la concentraci%u00f3n es de100 ng/mL, el valor obtenido fue de 96,50 %u00b17,56 ng/mL, con una recuperaci%u00f3n del 96,5%.4. dIsCUsI%u00d3NComo era de esperar, tal y como muestra laFigura 2.A, el electrodo desnudo present%u00f3 unbajo valor de Rct, igual a 315 %u03a9. Tras elgrafting electroqu%u00edmico, adicionando pABA(pKa 4,65) y NaNO2, se produce un incrementomuy acusado de la resistencia a latransferencia de carga (Rct = 24227 %u03a9). Esteaumento se debe fundamentalmente a larepulsi%u00f3n electrost%u00e1tica entre la superficieelectr%u00f3dica cargada negativamente debido a la presencia de los grupos carbox%u00edlicos del pABA, y la sonda redox Fe(CN)64%u2212/3%u2212, tambi%u00e9n con carga negativa. La activaci%u00f3n de los grupos carbox%u00edlicos con EDC/NHS provoca un descenso brusco de Rct igual a 2143 %u03a9 debido a la neutralizaci%u00f3n parcial de la carga negativa por activaci%u00f3n de los grupos carbox%u00edlicos. La uni%u00f3n del Ac de captura produce un aumento de Rct a 2581 %u03a9 debido al bloqueo de la superficie electr%u00f3dica por la capa de prote%u00ednainmovilizada. Como era de esperar, la adicci%u00f3nde BSA produce un aumento de Rct hasta 3880%u03a9. como consecuencia del mayor bloqueo desu`perficie electr%u00f3dica y de la repulsi%u00f3n entrela sonda Fe(CN)4%u2212/3%u2212 y el BSA (puntoisoel%u00e9ctrico 4,7), ambos cargadosnegativamente al pH de trabajo (pH 7,4).Sorprendentemente, tras la uni%u00f3n de MMP9 alAc de captura la resistencia a la transferenciade carga disminuye (Rct = 1650 %uf057 para MMP9de 1 ng/mL) y esta disminuci%u00f3n es tanto mayor conforme aumenta la concentraci%u00f3n de la metaloproteinasa. Estos resultadosconcuerdan con los observados mediante SWV,es decir, la corriente aumenta a medida que202ANALESRANFwww.analesranf.coman. r. acad. Farm.vol. 91. n%u00ba2 (2025) %u00b7 pp. 193-206 Label-free electrochemical inmunosensor formetaloproteinase 9 determinationIrene Charneco, Marta S%u00e1nchez, et al.