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Signos clínicos: Se midió de forma diaria el peso de los
animales, la consistencia de las heces y el contenido de sangre fecal.
Las deposiciones de los animales se puntuaron de 0 a 4, siendo 0
las deposiciones normales y 4 las diarreicas. En cuanto al contenido
de sangre fecal se analizó mediante el test Hemoccult (Beckman
Coulter). El índice de actividad diaria (DAI) se calculó teniendo en
cuenta de forma combinada los parámetros anteriormente descritos
(26).
Estudios histológicos: El daño en la mucosa colónica se
puntuó de la siguiente forma: 0, sin daño; 1, daño en la mucosa
solo; 2, daño en la mucosa y en la submucosa; 3, daño transmural.
Una sección del colon distal, obtenido tras el sacrificio del animal,
se fijó en formaldehído al 4% y se insertó en parafina. Secciones
de 5 mm se tiñeron con hematoxilina-eosina, tomando microfoto-
grafías con un microscopio equipado con cámara a 600 aumentos.
El grado de infiltración de los neutrófilos se obtuvo contando todos
los neutrófilos extrabasales por microfotografía. La puntuación ob-
tenida representa la media del contenido de neutrófilos en 4 zonas
aleatorias de mucosa y submucosa que proceden de tres secciones
diferentes del colon descendente.
Permeabilidad de la mucosa intestinal: Se estudió el in-
cremento de la permeabilidad en la mucosa intestinal de los distin-
tos grupos de animales usando como sonda fluorescente la
fluoresceína isotiocianato-dextrano (FD-4). Brevemente, se tomaron
muestras de colon de tres animales de cada grupo (n=3), se cerra-
ron mediante sutura y se llenaron con tampón bicarbonato de Krebs-
Henseleit (KHBB, pH 7.4). Posteriormente cada saco se suspendió
en KHBB que contenía FD-4 y se incubó durante 30 minutos a 37ºC
bajo una atmósfera de 02:CO2 (95:5). Finalmente, se tomó una
muestra de la solución serosa (donde se suspendió el saco) y mucosa
(contenido del saco), se centrifugaron y se midió la intensidad de
la fluorescencia. De esta forma, la permeabilidad se expresó como
la capacidad de aclaramiento de la FD-4 de la capa mucosa a la se-
rosa (27).
Mieloperoxidasa (MPO): Esta enzima se utiliza como mar-
cador de la infiltración de neutrófilos, aunque no es una enzima es-
trictamente específica de estos fagocitos. El análisis de la MPO se
analizó en tres segmentos colónicos de cada animal (28). Los tejidos
se homogeneizaron y centrifugaron, realizando el ensayo de la MPO
usando un kit comercial (Hbt. Biotechnology).
Determinaciones de citoquinas: El contenido de TNFa co-
lónico y de IL-6 e IL-10 plasmáticos se realizó mediante ELISA,
usando kits comerciales para cuantificar citoquinas murinas (Cytoset
kit, Biosource Internacional).
Regulation of the intestinal inflammatory response through the ingestion of
144 Maillard compounds and their interaction with RAGE and GPR43 receptors
Silvia Pastoriza y José Ángel Rufián-Henares
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº 2 (2021) · pp. 141 - 154
ANALES
RANF
www.analesranf.com
Ensayos quimiotácticos: La quimiotaxis de los neutrófilos
se estudió usando cámaras transwell mediante la técnica descrita
por Kawohl et al. (29). Los neutrófilos se aislaron a partir de un la-
vado peritoneal con suero salino estéril de ratones control,
Gpr43-/- y RAGE-/- (n = 3) 4 horas tras la administración de una
solución de tioglicolato 3%. Los neutrófilos se enumeraron tras tin-
ción de Meyer-Hemalaun. Para evaluar la acción de los AGEs (se
utilizó CML como AGE patrón) sobre el receptor GPR43 se utilizó un
anticuerpo monoclonal antiRAGE murino (R&D Systems Inc) para
bloquear la interacción AGE-RAGE.
2.4. Análisis estadístico
Para realizar el estudio estadístico se utilizó el programa
SPSS ver. 15. Las medidas se realizaron al menos en triplicado y la
normalidad de los datos se comprobó utilizando el test de Kolmo-
gorov-Smirnov. Los resultados se expresan como media ± desvia-
ción estándar. Los valores P se calcularon utilizando un test de
ANOVA multifactorial y el test de la t de student. Los valores de
P<0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
3. RESULTADOS
La regulación de la respuesta inmune a nivel intestinal es
muy compleja y dentro de ella juegan un papel importante los re-
ceptores RAGE y GPR43. Desde hace 5 años se está estudiando el
papel que juega el RAGE sobre la permeabilidad de la mucosa in-
testinal, así como sobre el reclutamiento de los neutrófilos. De igual
forma, recientemente se está evidenciando el papel fundamental
que juega el receptor GPR43 para regular el reclutamiento de las
células del sistema inmune hasta la mucosa intestinal ante deter-
minados estímulos microbianos. Sin embargo, hasta ahora no se
conoce si existe algún tipo de relación entre la actividad de ambos
receptores. En este sentido, en el presente trabajo se evalúa cómo
se activan dichos receptores mediante la administración de una pro-
teína rica en AGEs y se estudia qué papel juegan en el desarrollo
de la inflamación intestinal. Para ello, se utiliza un modelo murino
de enfermedad inflamatoria intestinal, ya que se disponen de ra-
tones transgénicos comerciales que carecen de los receptores GPR43
y RAGE donde se puede inducir una colitis aguda o crónica. Así
mismo, tras estudiar el efecto de los AGEs ante una situación pato-
lógica, es evalúa su efecto durante una ingesta prolongada, eva-
luando si dicha ingesta puede incrementar el riesgo de desarrollar
la enfermedad. Finalmente, para reforzar los hallazgos encontrados
se estudian los efectos de una terapia con exRAGE y propionato
sobre la inflamación intestinal inducida con DSS.