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DISEÑO
DE
UN
GENOSENSOR…

Con
el
fin
de
conocer
la
especificidad
de
la
secuencia
elegida

como
analito

se
utilizó
el
programa
BLAST
(16)
comprobándose
que
sólo
tiene
homologías
con

secuencias
específicas
de
trigo
y
no
con
otras
especies
como
hongos
y
bacterias

ambientales,
que
podrían
generar
interferencias
en
el
análisis.

Para
predecir
las
posibles
estructuras
secundarias
del
fragmento
de
ADN
y

su
hibridación
con
la
sonda
de
captura
e
indicadora,
se
utilizó
una
base
de
datos

llamada
Mfold
web
Server
(17).
La
estructura
secundaria
tipo
mango-­-bucle
de
la

sonda
de
captura
presenta
una
energía
libre
?G=
-­-10,7
Kcal/mol.
La
formación
del

híbrido
analito-­-sonda
de
captura
presenta
una
?Gdúplex=
-­-49,8
kcal/mol,

demostrando
la
apertura
espontánea
de
la
sonda
en
presencia
de
analito.
El
analito

y
sonda
indicadora
poseen
una
estructura
secundaria
cuya
formación
presenta

valores
de
?G
=
-­-12,5
Kcal/mol
y
?G
=
-­-13,2
Kcal/mol
respectivamente,
superiores

a
la
energía
del
híbrido
analito-­-sonda
indicadora
(?G
=
-­-113,1
Kcal/mol),
lo
que

indica
la
hibridación
espontánea
de
la
sonda
indicadora

con
el
híbrido
analito-­-
sonda
de
captura.

3.3.
Caracterización
de
los
electrodos
serigrafiados

Para
comprobar
reproducibilidad
de
la
superficie
electródica,
se
realizaron

voltamperometrías
cíclicas
entre
+0,6
a
-­-0,1
V
(60
mV/s,
10
barridos)
con

ferrocianuro
de
potasio
0,5
mM
en
buffer
2xSSPE
(18,
19).
Se
midió
la
intensidad

del
pico
de
oxidación
para
10
electrodos
pretratados
con
H2SO4,
y
obteniéndose
un

coeficiente
de
variación
de
5,7%,
confirmando
la
adecuada
reproducibilidad
del

proceso
de
serigrafiado.

3.4.
Ensayos
preliminares
de
respuesta
del
genosensor

Se
estudió
la
interacción
entre
la
sonda
de
captura
y
el
híbrido
analito-­-

sonda
indicadora
y
se
evaluó
la
especificidad
de
esta
interacción
mediante
el
uso

de
una
secuencia
no
complementaria.
Para
determinar
el
ruido
de
fondo
originado

en
parte
por
las
uniones
inespecíficas
a
la
superficie
electródica
de
los
reactivos

utilizados,
se
realizó
un
ensayo
del
blanco.
Estos
ensayos
se
realizaron
con
sonda

horquilla
2
µM;
MCH
4,5
mM;
sonda
indicadora
2
µM;
ALP-­-Strp
4,3·10-­-3
g/L
y

1-­-
naftil-­-P
4
mM.

El
ensayo
con
la
sonda
no
complementaria
dio
una
intensidad
de

1,1
µA

similar
a
la
obtenida
en
el
ensayo
del
blanco.
En
estas
mismas
condiciones

experimentales,
una
concentración
de
analito
1
µM
dio
una
intensidad
de
9,54
µA

(Figura
3),
aproximadamente
9
veces
superior
al
blanco
y
al
ensayo
negativo.
Estos

resultados
muestran
la
especificidad
del
método
propuesto.

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