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DISEÑO
DE
UN
GENOSENSOR…

2.3.
Procedimiento
experimental

A.-­-
Sonda
de
captura

Con
el
objetivo
de
reducir
los
enlaces
disulfuro
S-­-S,
formados
por
la
unión

de
dos
moléculas
ADN-­-SH
(14,
15)
se
procedió
a
su
tratamiento
con
DTT.
Para
ello

se
disolvió
el
contenido
del
vial
(63,6
nmol
de
sonda
de
captura)
en
100
µL
de
una

disolución
acuosa
de
DTT
0,1
M
y
se
dejó
a
temperatura
ambiente
durante

aproximadamente
24
h.
A
continuación,
la
sonda
tiolada
fue
purificada
por
elución

en
una
columna
NAP-­-10
de
Sephadex
G-­-25
(lecho
de
dextrano)
con
1,5
mL
de
agua

Milli-­-Q.
Se
determinó
la
concentración
real
midiendo
su
absorbancia
a
260
nm,

encontrándose
un
97
%
de
recuperación
respecto
a
la
cantidad
inicial
del
vial.
Esta

disolución
fue
almacenada
en
el
congelador.

B.-­-
Preparación
del
sensor

Preparación
de
la
fase
sensora.

Inmovilización
de
la
sonda
de
captura
mediante
quimisorción
(unión

covalente
ADN-­-SH
–
Au).
Se
depositan
sobre
el
electrodo
40
µL
de
una
disolución

de
la
sonda
de
captura
en
buffer
2xSSPE
pH
7,4
(buffer
de
hibridación
y
de

inmovilización)
dejándose
en
atmósfera
cerrada
y
saturada
con
agua
durante
1
h
y

lavado.

Bloqueo
electródico

Se
adicionan
40
µL
de
una
disolución
de
MCH
en
buffer
2xSSPE,
dejándose

30
min,
seguido
de
lavados.

Etapa
de
hibridación

• Homogénea.
Se
mezcla
la
disolución
del
analito
con
la
sonda
indicadora
en

buffer
2xSSPE
(Figura
2A),
calentando
durante
5
min
a
100
ºC
y

sumergiendo
5
min
en
hielo.

• Heterogénea.
Se
depositan
40
µL
de
la
disolución
anterior
sobre
la
fase

sensora.
Se
espera
1
hora
y
se
lava
(Figura
2B).

Marcaje
enzimático
y
detección
electroquímica

Concluida
la
hibridación,
sobre
la
fase
sensora
se
añaden
40
µL
de

disolución
del
conjugado
ALP-­-Strp
en
buffer
bloqueante
o
de
incubación
(5xSSPE

pH
7,4,
2%
BSA
y
0,1%
Tween
20
(Figura
2C),
se
deja
10
min
y
se
lava.

Se
añaden

40
µL
de
1-­-naftilfosfato
4
mM
en
buffer
de
medida
(0,5
M
Tris-­-HCl,
1
mM
MgCl2,
0,1

M
KCl,
pH
9,8).
Transcurridos
10
min
de
incubación,
se
realiza
la
medida

voltamperométrica
(DPV)
de
0
a
+0,6
V
(amplitud
de
pulso
20
mV
y
velocidad
de

barrido
10
mV/s)
(Figura
2D
y
E),
desechando
el
electrodo
tras
la
medida.

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