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VOL. 75 (1), 5-23, 2009 NUEVO MODELO CELULAR PARA EL ESTUDIO DE LA...

tal y 0,2 ng/ml de cardiotrofina-1, 20 mM de Hepes y la mezcla de an-
tibióticos y antifúngicos.

2.2. Curva de dosis - respuesta frente un estímulo

Para estudiar cómo responden los cardiomiocitos de ratón frente
a varios estímulos, se procedió a la realización de curvas de dosis –
respuesta. Así, se sembraron las células y una vez que alcanzaron el
60-70% de confluencia, se procedió a la retirada de suero durante 15
horas. En el caso del ácido oleico se utilizó un medio de retirada con
0,5% de suero fetal y 500µM de albúmina, para intentar reproducir in
vitro la situación que ocurre en diabetes.

Una vez trascurrido ese tiempo, se estimularon las células con con-
centraciones crecientes de insulina en un rango desde 10 pM a 100
nM, durante un tiempo de 5 minutos.

También se realizaron estimulaciones con ácido oleico, para estu-
diar como respondían los cardiomiocitos a los ácidos grasos. En este
caso los estímulos se llevaron a cabo con concentraciones de entre
200 y 800 µM, durante una hora.

2.3. Curva de tiempo

Se realizaron curvas de tiempo frente a ambos estímulos: insulina y
ácido oleico. Para ello se procedió a la retirada de suero de las células
una vez que alcanzaron el 60-70% de confluencia, durante 15 horas.

Los estímulos se llevaron a cabo con 10 nM de insulina y 800 µM
de ácido oleico. Para ambos el tiempo de estimulación fue de 0, 5, 10,
15, 30 y 60 minutos.

2.4. Obtención de extractos de proteínas

Las placas de cultivo se lavaron dos veces con PBS frío y posterior-
mente se lisaron a 4ºC (sobre hielo) en 100 - 500 µl de tampón de lisis
(EDTA 5mM, NaCl 50 mM, Pirofosfato sódico 30 mM, NaF 50 mM,

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