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OTERO, Y. F. & DE LAS HERAS, B. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

Na3VO4 100 µM, Tritón X-100 1%, Tris pH 7,6 10 mM, PMSF 1mM,
Aprotinina 1 mM, Leupeptina 1 mM).

Las células se levantaron de la placa mediante raspado y lisado se
colocó rápidamente en tubos de 1,5 ml. Los lisados se centrifugaron
a 13.000 rpm durante 10 minutos, a continuación se transfirieron los
sobrenadantes a tubos nuevos para su uso inmediato o congelación
a –70ºC.

2.5. Cuantificación de proteínas

La cuantificación de las proteínas obtenidas, se realizó mediante el
ensayo descrito por Bradford (13). Para ello se usó el agente “Bio-Rad
protein assay” (Bio-Rad) y albúmina de suero bovino (Bio-Rad protein
Assay standard H, Bio-Rad) para preparar una curva patrón. La cuan-
tificación se realizó mediante la adición del reactivo de Bradford y la
lectura espectrofotométrica a una longitud de onda de 595 nm.

2.6. Electroforesis de proteínas

Una vez valorados los lisados, se prepararon las muestras de forma
que todas contuvieran la misma cantidad de proteínas, alrededor de 20-
60 µg, y se mezclaron en proporción 1:1 con un tampón compuesto por:
Tris 72 mM pH 7,6, glicerol 10% (v/v), SDS 1% (p/v), azul de bromofenol
0,002% (p/v), y ß-mercaptoetanol 2 mM. Así preparadas, las muestras
se guardaron a -20 ºC hasta el momento de la electroforesis (SDS-
PAGE). Estas muestras se calentaron a 90-100 ºC durante 5 minutos y
se cargaron en el gel de electroforesis. En un carril del mismo gel se
cargó un patrón de pesos moleculares, con una mezcla de proteínas de
tamaños conocidos (Prestained SDS-PAGE Standards Bio Rad ref # 161-
0318). El porcentaje del gel de poliacrilamida varió en función del
tamaño de la proteína que se quería estudiar en cada momento.

2.7. Transferencia de proteínas

Una vez separadas suficientemente las proteínas mediante la elec-
troforesis se procedió a la transferencia de las mismas a una mem-

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