Page 12 - 75_01

OTERO, Y. F. & DE LAS HERAS, B. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

hibidores de la proteína PI3K, se realizó durante 30 minutos previos
en el mismo medio de deprivación, a una concentración de 40 nM de
Wortmanina y 10 nM de LY 294002 (ambos de Sigma). Por último, la
incubación con ácido oleico (Sigma) se realizó durante 1 hora a una
concentración de 800 µM. Todos los estímulos se mantuvieron durante
la incorporación de glucosa tritiada. La incorporación de 2-deoxy-D-
(1-3H)-glucosa (500 nCi/ml, Amersham Biosciences) se midió durante
los últimos 10 minutos de incubación. Transcurrido este tiempo las
células se lavaron 3 veces con KRH y se solubilizaron en 1 ml – 500
µl de SDS 0,1%. La radiactividad de una alícuota de 200 µl fue deter-
minada en 2 ml de líquido de centelleo (Ultima Gold®) en un conta-
dor de radiación beta.

3. RESULTADOS

Para la inmortalización de los cardiomiocitos se obtuvo primero
el DNA del antígeno T mediante purificación de la banda del gel de
agarosa. Una vez transfectadas con el DNA, y después de la selección
con puromicina, se comprobó la inmortalización mediante western
blot contra antígeno T y contra p53. La presencia de ambas proteínas
confirma que las células son inmortales (Figura 1).

Para comprobar que las células inmortalizadas y seleccionadas son
realmente cardiomiocitos y se eliminó la contaminación por otros
tipos celulares como fibroblastos, estás células deben poseer la frac-
ción específica de corazón de la proteína Troponina T, como así se de-
muestra en el western blot directo realizado (Figura 2A).

En determinados tejidos, al inmortalizar las líneas celulares, se
puede producir un cambio en la relación de expresión de los trasporta-
dores de glucosa GLUT1 y GLUT4, lo que posteriormente puede reper-
cutir en la señalización celular. Se realizó un western blot contra es-
tos transportadores, comparando los cardiomiocitos obtenidos con
otros tipos celulares y con tejidos (Figura 2B). Se puede observar que
la expresión de Glut 4 en cardiomiocitos neonatales es muy inferior
a la de otros tipos celulares.

Se caracterizó la ruta de señalización intracelular de la insulina
(Figura 2C) y se observó que los cardiomiocitos neonatales expresan ya

14