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OTERO, Y. F. & DE LAS HERAS, B. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

2.1. Cultivo primario

Se realizó a partir de los corazones de los neonatos en grupos de
3. Se trocearon los corazones y se introdujeron en 1 ml de una solu-
ción de PBS 1x con 1,2 mg/ml de colagenasa (Colagenasa tipo 2,
Worthington) y 10 µg/ml DNAsa (DNAsa I grado II, Roche). Para la
disgregación del tejido, se incubó el tubo en un baño a 37 ºC, dentro
de la campana de flujo laminar, durante 10-20 min; tiempo durante
el que se realizó un pipeteo suave y continuo para separar las célu-
las. Una vez hecho esto, se tomó el sobrenadante, desechando el teji-
do restante, y se añadieron entre 3-5 ml de suero fetal bovino.
Dependiendo del número de ratones neonatos, este ciclo se repitió
varias veces, siempre tratando los corazones en grupos de 3.

A continuación, se centrifugaron los tubos con el suero fetal du-
rante 5 min a 1000 rpm. Se eliminó el sobrenadante y se resus-
pendieron las células mediante un pipeteo suave, en 1 ml de medio
de “cardiomiocitos” (DMEM y M199 (3:1), 5% de suero fetal bovino,
10% de suero de caballo, 20 mM de HEPES, 0,2 ng/ml de cardiotro-
fina-I (R&D Systems), 1µM de insulina (Sigma) y una mezcla de an-
tibióticos y antifúngicos).

Posteriormente se sembraron las células en platos normales
(Falcon) durante 45 min para así eliminar los fibroblastos del sobre-
nadante. Pasado ese tiempo, el sobrenadante se sembró en platos pre-
viamente tratados con colágeno (Collagen from rat tail, Roche Applied
Sciences) disuelto en una solución de PBS al 0,2% de ácido acético,
para así facilitar la adhesión de los cardiomiocitos.

Después de dos días de estabilización del cultivo primario, se pro-
cedió a la inmortalización de las células mediante infección retrovi-
ral con la construcción pBABE puro-antígeno T. Las células infectadas
fueron seleccionadas por la adición al medio de cultivo del antibióti-
co de selección, en este caso puromicina, a una concentración de 0,5
µg/ml, durante un tiempo de entre 2 y 3 semanas.

En todos los casos se observó que las células mantenían las mis-
mas propiedades proliferativas tras repetidos pases y procesos de con-
gelación-descongelación.

Una vez superado el tiempo de selección, las células se mantu-
vieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fe-

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