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VOL. 75 (1), 5-23, 2009 NUEVO MODELO CELULAR PARA EL ESTUDIO DE LA...

brana de poli vinil difluoruro o PVDF (Immobilon-P©) mediante el
paso de corriente eléctrica. Esta transferencia se realizó según dos
métodos: utilizando el equipo de transferencia Trans-blot SD Semy-dry
de Bio Rad y un tampón compuesto por glicina 40 mM, metanol al
20% (v/v) y Tris 48 mM pH 8,3; a 15 V durante un tiempo variable en
función del tamaño del gel, el espesor y porcentaje de acrilamida del
mismo y el tamaño de la proteína en estudio. Y para la transferencia
de proteínas de alto peso molecular, se utilizó el equipo de transfer-
encia por húmedo de Bio Rad y un tampón compuesto por: glicina
386 mM, SDS 0,1 %, metanol 20% y Tris 66 mM pH 8,5. Esta trans-
ferencia se lleva a cabo a 100 V durante 2 horas.

Finalizada la transferencia, se realizó el bloqueo o saturación de
todos los sitios inespecíficos de unión de proteínas en la membrana
de PVDF. Para ello, la membrana fue incubada 2 horas con agitación
suave en solución de bloqueo, preparada con TBS (NaCl 150 mM, Tris
10 mM pH 7,3) suplementado con leche en polvo desnatada al 5%
(p/v) o BSA al 3% (p/v). Posteriormente, se eliminó este tampón y se
añadió el anticuerpo primario correspondiente diluido en TTBS (TBS
con 0,05% de Tween-20), incubándose con agitación suave a 4 ºC du-
rante toda la noche. Tras esta incubación se realizaron 4 lavados suce-
sivos de 10 minutos cada uno con el tampón de lavado TTBS. A con-
tinuación se añadió el anticuerpo secundario (un anticuerpo de cabra
dirigido contra las inmunoglobulinas de ratón o conejo y conjugado
con una peroxidasa de rábano) y con él se incubó la membrana de
polivinilo durante al menos 1 hora a 4ºC. Finalmente se realizaron
otros 4 lavados con TTBS y se procedió al revelado, consistente en la
detección de la peroxidasa fijada mediante una técnica quimiolu-
miniscente, utilizando el equipo de detección comercializado por
Amersham (ECL) y películas fotográficas de alta sensibilidad de la
misma casa.

2.8. Medida de la captación celular de glucosa

La línea celular en estudio, sin suero y con medio bajo en glucosa
durante 4 horas, se lavó 3 veces con medio KRH (NaCl 136mM, KCl
4,7 mM, CaCl2 1mM, MgSO4 1mM, Hepes 20mM, 1% BSA) y seguida-
mente se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en 1 ml de KRH en
presencia o ausencia de insulina (10-100 nM). La incubación con in-

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