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VOL. 74 (2), 181-201, 2008 ARILESTERASA. ASPECTOS METODOLÓGICOS...

FIGURA 1. Esquema del método propuesto por Lorentz y col. (13).

Las medidas se llevan a cabo a 37º C y a un pH = 7,73 a una
longitud de onda de 405 nm (a la que absorbe el hexacianohierro-
III). En algunas de las muestras, cuando las velocidades iniciales
eran muy pequeñas, se sustituyó el hexacianohierro-III por ácido
5-5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico) haciéndose las medidas a 546 nm (17).
Sin embargo este método resulta muy largo y tedioso para ser em-
pleado como ensayo de rutina.

Otro método espectrofotométrico es el descrito por Butte y col. (18)
usando como sustratos acetato y benzoato de p-nitrofenilo en un tam-
pón fosfato 66 mM con 0,1% de Triton X-100 a pH = 7,5 y 37º C. El
método se basa en el incremento de absorbancia a 321 nm, debido al
aumento de concentración de a-naftol (producto de la hidrólisis de la
arilesterasa sobre los sustratos). El inconveniente de este método es
que los ésteres del a-naftol no son sustratos específicos de este enzima.

Los estudios llevados a cabo por Debord y col. (19-21) con muchos
de los inhibidores de la actividad arilesterasa llevaron a la conclusión
de que el método espectrofotométrico tenía muchas limitaciones por
el efecto de los inhibidores de la actividad arilesterasa. Por ello pensa-
ron que desarrollando un método microcalorimétrico evitarían estos
problemas. Estos autores han puesto a punto un método calorimétri-
co usando acetato de fenilo como sustrato en un tampón Tris/HCl
9 mM con 1 mM CaCl2 a pH = 8 y 37º C. Se mezcla la disolución
de sustrato con el enzima purificado en un microcalorímetro y se
mide la diferencia de entalpía hasta que se alcanza el estado estacio-
nario (22). Los resultados obtenidos se ajustaron a una ecuación in-
tegrada de Michaelis-Menten no linear y se ajustó por mínimos cua-
drados (22). Observaron que se trata de una reacción ligeramente
endotérmica (?H = 8,2 kJ mol–1) (18). Sus resultados coinciden con los
de Lorentz y col. (17). Sin embargo el manejo de la microcalorimetría

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