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GEMMA NAVARRO DÍEZ Y C. TROS DE ILARDUYA AN. R. ACAD. NAC. FARM.

troscopia UV midiendo la absorbancia del DNA plasmídico purifica-
do a 310, 280 y 260 nm en un espectrofotómetro UV-visible Hewlett
Packard 8452 (EE.UU.). El cociente de las absorbancias A260/A280 de
todas las muestras fue siempre mayor o igual a 1,8, indicando un
grado de pureza adecuado para el plásmido. La concentración del
plásmido se calculó mediante la ley de Lambert-Beer, según la cual
una unidad de absorción a 260 nm equivale a 50 µg/mL de DNA de
doble cadena o a 40 µg/mL de DNA de cadena sencilla.

Además, para garantizar la pureza del pDNA, las muestras fueron
sometidas a digestión con enzimas de restricción, comparando los
fragmentos obtenidos con los productos de digestión obtenidos de un
pCMVLuc patrón. Para ello se tomó 1 µg de pDNA, 0,5 µL de enzima
Pst I, 0,5 µL de enzima Xho I, 2 µL de REact® 2 (Invitrogen Life Tech-
nologies, Reino Unido) y la cantidad suficiente de agua para alcanzar
20 µL. Tras mantener la muestra en un baño a 37º C durante 2 horas,
se analizaron los productos de la digestión mediante electroforesis en
gel de agarosa al 0,8% usando TBE como buffer. La fuente electrofo-
rética utilizada fue un Power Pac 300 de Bio Rad (EE.UU.). Las mues-
tras se sometieron a un voltaje continuo de 80 mV durante 2 horas. El
DNA se visualizó mediante luz UV en una cámara oscura de aislamien-
to Gel doc 2000 (Bio Rad, EE.UU.) tras la intercalación con bromuro
de etidio.

2.2. Preparación de los sistemas PAMAM/DNA

Los complejos se prepararon mediante la mezcla de volúmenes
iguales de una solución de pDNA con una solución del dendrímero
(PAMAM G4 o PAMAM G5), ambas preparadas en BHG (Buffer He-
pes Glucosado) (HEPES 10 mM, glucosa al 10%, pH 7,4). La mezcla
se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La concentra-
ción final del DNA en los complejos fue de 5 µg /mL.

Las cantidades de dendrímero y DNA fueron calculadas para ob-
tener complejos a distintas relaciones de carga (+/–) respecto al
número de grupos amino terminales del polímero frente al número
de grupos fosfato del DNA. Para cada generación de dendrímero se
obtuvieron complejos con relaciones de carga desde 1/1 hasta 10/1
(PAMAM/DNA). Dado que las generaciones del polímero fueron su-

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