Page 65 - 74_02

VOL. 74 (2), 229-256, 2008 DISEÑO Y DESARROLLO DE NUEVAS...

cer de colon de ratón). Se platearon 3 × 105 células por pocillo en
DME-10 sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Ja-
pón). Cuando el grado de confluencia fue del 80% se procedió a la
transfección. En cada pocillo se añadieron 300 µL de FBS completo
activado y 200 µL complejo, de forma que la concentración final de
FBS en el pocillo fue del 60%. La cantidad de pDNA por pocillo fue
de 1 µg. Tras 4 horas de incubación a 37º C y 5% CO2 en un incuba-
dor (Forma Scientific, Inc, CO2 water Jacked incubator 3121, EE.UU.),
se retiró el medio de transfección y se añadió DME-10. Después de
48 horas, las células se lavaron con PBS y se lisaron con 100 µL de
buffer de lisis 1X (RLB, «Reporter Lisis Buffer») (Promega, EE.UU.).
Posteriormente se sometieron a dos ciclos de congelación-desconge-
lación a –80%. El contenido de cada pocillo se centrifugó a 12.000 g
durante 10 minutos. Se analizaron 20 µL del sobrenadante obtenido,
midiendo la expresión de luciferasa con el kit «Luciferase Assay» y la
cantidad de proteína total mediante el kit «Bio-Rad Dc Protein Assay».
Los resultados se expresaron en ng de luciferasa por mg de proteína.

2.9. Estudios de viabilidad celular

Los estudios de viabilidad celular se llevaron a cabo mediante el
ensayo «Alamar Blue», que permite cuantificar la proliferación celu-
lar. Para ello, se plantearon 3 × 105 células por pocillo en DME-10
sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Japón). Las
células fueron transfectadas según el procedimiento del epígrafe
anterior. Tras 4 horas de incubación a 37º C y 5% CO2, se retiró el
medio de transfección y se añadió DME-10. Después de 48 horas, se
retiró el medio de cultivo y se añadió 1 mL de solución de Alamar
Blue al 10% en DME-10. Tras 2 horas de incubación, se determinó
la absorbancia a 570 y 600 nm de 200 µL de sobrenadante, mediante
un lector de placas iEMS READER (Labsystem, Finlandia). El por-
centaje de viabilidad de las células tratadas con cada uno de los
complejos, se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

% viabilidad = (A570 - A600) células tratadas×100
(A570 - A600) células sin tratar

243