Page 111 - 74_02

VOL. 74 (2), 283-306, 2008 DESARROLLO, ANÁLISIS Y OPTIMIZACIÓN DE MODELOS...

en medio de cultivo DMEM (Gibco BRL, Paisley, UK) con 15% de
suero humano y 50 mg/mL de gentamicina. Una vez las células al-
canzaron la confluencia, se despegaron con tripsina-EDTA (0,25%/
0,02%) y se sembraron bajo las mismas condiciones de cultivo a una
densidad de 5 × 103 células/cm2.

Caracterización de las células madre mesenquimales
de tejido adiposo (ADSC)

El análisis por citometría de flujo se llevó a cabo con un citómetro
de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA) tras
marcar 1 × 106 células con sus respectivos anticuerpos conjugados.
7-AAD se utilizó para excluir las células no viables del análisis y las
tinciones no específicas se realizaron según se ha descrito previamen-
te (5). Los anticuerpos monoclonales contra antígenos humanos
CD13-PE, CD34-APC, CD45-FITC, CD90-APC se obtuvieron de Becton
Dickinson (Mountain View, CA) y CD105-PE de Serotec, Oxford, UK.

Protocolo para la diferenciación hepatogénica de las células
madre mesenquimales de tejido adiposo (ADSC)

Para conseguir la transdiferenciación de las células mesenqui-
males a linaje hepático se desarrolló un protocolo basado en un
acondicionamiento de las células mediante el cultivo durante dos días
con medio base (DMEM sin suero y gentamicina) complementado con
EGF 20 ng/mL (Sigma, Madrid, España), FGFb y FGF4 10 ng/ml (Life
Technologies, Barcelona, España) y BMP2 y BMP4 50 ng/ml (Sigma,
Madrid, España). A continuación las células se mantuvieron durante
siete días en el medio base pero complementado con HGF 20 ng/ml
(PeproTech EC, Londres, UK), FGFs 10 ng/ml y nicotinamida 4,9 mM
(Sigma, Madrid, España) (Etapa 1) y, finalmente (Etapa 2), las células
se cultivaron entre 7-14 días en medio base complementado con OSM
20 ng/ml (PeproTech EC, Londres, UK), dexametasona 1 mM (Merck
Pharma, Mollet del Vallés, España) e ITS premix (BD Biosciences,
Madrid, España).

289